Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.
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Artículo de método
Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado
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Resumen
Resumen
El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la meiosis y la espermatogénesis. Aunque existen protocolos de aislamiento celular establecidos que utilizan la tinción Hoechst 33342 en combinación con la clasificación celular activada por fluorescencia, requiere clasificadores celulares equipados con un láser ultravioleta. Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV), un tinte de unión de ADN de baja citotoxicidad estructuralmente similar a Hoechst 33342. DcV puede ser excitado por láseres ultravioleta y violeta, lo que mejora la flexibilidad de la elección del equipo, incluyendo un clasificador de células no equipado con un láser ultravioleta. Usando este protocolo, uno puede aislar tres subpoblaciones de células vivas en la profase meótica I, incluyendo leptoteno/zygotene, paquiteno y espermatozoides diploteno, así como espermatozoides redondos post-meyóticos. También describimos un protocolo para preparar la suspensión de una sola célula a partir de testículos de ratón. En general, el procedimiento requiere un corto tiempo para completarse (4-5 horas dependiendo del número de celdas necesarias), lo que facilita muchas aplicaciones posteriores.
Introducción
La espermatogénesis es un proceso complejo en el que una pequeña población de células madre espermatogoniales sostiene la producción continua de un gran número de espermatozoides a lo largo de la vida adulta1,2. Durante la espermatogénesis, la remodelación dinámica de la cromatina tiene lugar cuando las células espermatogénicas se someten a meiosis para producir espermatozoides haploideos3,4,5. El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para la investigación molecular, y se han establecido varios enfoques ....
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Protocolo
Este protocolo sigue las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolo no. IACUC2018-0040) en Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Configuración de equipos y reactivos para la preparación de la suspensión de células testiculares
- Preparar cada stock enzimático en 1x Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hanks y almacenar a -20 oC.(Tabla1).
NOTA: Prepárese en cualquier momento antes del experimento. - Un día antes del experimento: Recubrir tubos recolectan (1,5 ml de tubos) con suero bovino fetal (FBS) a 4oC durante la noche.
- El día del experimento: Aj....
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Resultados
Un resultado representativo de este protocolo de clasificación se muestra en la Figura 3. El tiempo total de clasificación de dos testículos (un ratón) suele ser de alrededor de 3 horas, lo que depende de la concentración de la suspensión celular y de la velocidad de clasificación. Después de la clasificación, la pureza de los espermatocitos se confirma mediante la inmunostaining de SYCP3 y de laFigura 3A ( Figura 3A). La pureza representativa de las fracciones .......
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Discusión
Aquí presentamos un protocolo práctico y simple para aislar las subpoblaciones de espermatozoides y espermatozoides de un solo ratón macho adulto. Para garantizar la reproducibilidad de este protocolo, hay algunos pasos críticos que necesitan atención. Antes de la digestión enzimática, el paso de lavado tiene como objetivo eliminar las células intersticiales; después de la digestión, este paso ayuda a eliminar los espermatozoides y los desechos. Lavar/centrifugar 3 veces es importante. En nuestra receta de tampón de diso.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros de los laboratorios Namekawa, Yoshida y Maezawa por su ayuda; Katie Gerhardt por editar el manuscrito; Mary Ann Handel por compartir el anticuerpo H1T, el Núcleo de Citometría de Flujo de Investigación del Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) para compartir el equipo FACS apoyado por NIH S10OD023410; Subvención en Ayuda para la Investigación Científica (KAKENHI; 17K07424) a T.N.; Beca Postdoctoral de la Fundación Lalor a A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) a S.Y.; la Beca de Proyectos de Investigación de la División de Servicios de Investigación de la Universidad de Azabu, Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Cienci....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de 1,5 ml | Watson | 131-7155C | |
| Placa de Petri de 100 mm | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Tubo de centrífuga | Watson | 1332-015S Tubo de | |
| poliestireno de 5 ml con tapón a presión de filtro celular (35 µ m malla de nylon) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Tubo de centrífuga | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Placa de Petri | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µ m malla de nylon | Corning, Falcon | 352350 | |
| Clasificador de células | Sony | SH800S | |
| Centrífuga | |||
| Colgenasa, recombinante, sin origen animal | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Colagenasa, Tipo 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cubreobjetos | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato) | Fisher | D1306 | concentración de trabajo: 0.1 μ g/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Suero Burro | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t anticuerpo | de Mary Ann Handel | 1/2000 Hank' diluido | |
| s solución salina equilibrada (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| hialuronidasa de testículos bovinos | Sigma | H3506-1G | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade | Mountant Fisher | P36930 | |
| rH2AX anticuerpo | Millipore | 05-635 | concentración de trabajo: 2 μ g/mL |
| de proteína de fertilización de espermatozoides 56 (Sp56) anticuerpo | QED Bioscience | 55101 | concentración de trabajo: 0,5 μ g/mL |
| Pinzas y tijeras | |||
| Superfrost /Plus Portaobjetos de microscopio | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 anticuerpo | Abcam | ab205846 | concentración de trabajo: 5 μ g/mL |
| TWEEN 20 (Polisorbato 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Baño |
Referencias
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives ....
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