Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Summary

Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.

Abstract

El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la meiosis y la espermatogénesis. Aunque existen protocolos de aislamiento celular establecidos que utilizan la tinción Hoechst 33342 en combinación con la clasificación celular activada por fluorescencia, requiere clasificadores celulares equipados con un láser ultravioleta. Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV), un tinte de unión de ADN de baja citotoxicidad estructuralmente similar a Hoechst 33342. DcV puede ser excitado por láseres ultravioleta y violeta, lo que mejora la flexibilidad de la elección del equipo, incluyendo un clasificador de células no equipado con un láser ultravioleta. Usando este protocolo, uno puede aislar tres subpoblaciones de células vivas en la profase meótica I, incluyendo leptoteno/zygotene, paquiteno y espermatozoides diploteno, así como espermatozoides redondos post-meyóticos. También describimos un protocolo para preparar la suspensión de una sola célula a partir de testículos de ratón. En general, el procedimiento requiere un corto tiempo para completarse (4-5 horas dependiendo del número de celdas necesarias), lo que facilita muchas aplicaciones posteriores.

Introduction

La espermatogénesis es un proceso complejo en el que una pequeña población de células madre espermatogoniales sostiene la producción continua de un gran número de espermatozoides a lo largo de la vida adulta^1,2. Durante la espermatogénesis, la remodelación dinámica de la cromatina tiene lugar cuando las células espermatogénicas se someten a meiosis para producir espermatozoides haploideos^3,4,5. El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para la investigación molecular, y se han establecido varios enfoques ....

Protocol

Este protocolo sigue las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolo no. IACUC2018-0040) en Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Configuración de equipos y reactivos para la preparación de la suspensión de células testiculares

1. Preparar cada stock enzimático en 1x Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hanks y almacenar a -20 oC.(Tabla1).
   NOTA: Prepárese en cualquier momento antes del experimento.
2. Un día antes del experimento: Recubrir tubos recolectan (1,5 ml de tubos) con suero bovino fetal (FBS) a 4oC durante la noche.
3. El día del experimento: Aj....

Results

Un resultado representativo de este protocolo de clasificación se muestra en la Figura 3. El tiempo total de clasificación de dos testículos (un ratón) suele ser de alrededor de 3 horas, lo que depende de la concentración de la suspensión celular y de la velocidad de clasificación. Después de la clasificación, la pureza de los espermatocitos se confirma mediante la inmunostaining de SYCP3 y de laFigura 3A ( Figura 3A). La pureza representativa de las fracciones .......

Discussion

Aquí presentamos un protocolo práctico y simple para aislar las subpoblaciones de espermatozoides y espermatozoides de un solo ratón macho adulto. Para garantizar la reproducibilidad de este protocolo, hay algunos pasos críticos que necesitan atención. Antes de la digestión enzimática, el paso de lavado tiene como objetivo eliminar las células intersticiales; después de la digestión, este paso ayuda a eliminar los espermatozoides y los desechos. Lavar/centrifugar 3 veces es importante. En nuestra receta de tampón de diso.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de 1,5 ml	Watson	131-7155C
Placa de Petri de 100 mm	Corning, Falcon	351029
15 mL Tubo de centrífuga	Watson	1332-015S Tubo de
poliestireno de 5 ml con tapón a presión de filtro celular (35 µ m malla de nylon)	Corning, Falcon	352235
50 mL Tubo de centrífuga	Watson	1342-050S
60 mm Placa de Petri	Corning, Falcon	351007
70 µ m malla de nylon	Corning, Falcon	352350
Clasificador de células	Sony	SH800S
Centrífuga
Colgenasa, recombinante, sin origen animal	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-23141
Colagenasa, Tipo 1	Worthington	LS004196
Cubreobjetos	Fisher	12-544-G
Cytospin 3	Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)	Fisher	D1306	concentración de trabajo: 0.1 μ g/mL
Dnase I	Sigma	D5025-150KU
Suero Burro	Sigma	S30-M
Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)	Gibco	14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11885076
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	16000044
Histone H1t anticuerpo	de Mary Ann Handel		1/2000 Hank' diluido
s solución salina equilibrada (HBSS)	Gibco	14175095
hialuronidasa de testículos bovinos	Sigma	H3506-1G
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma	P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade	Mountant Fisher	P36930
rH2AX anticuerpo	Millipore	05-635	concentración de trabajo: 2 μ g/mL
de proteína de fertilización de espermatozoides 56 (Sp56) anticuerpo	QED Bioscience	55101	concentración de trabajo: 0,5 μ g/mL
Pinzas y tijeras
Superfrost /Plus Portaobjetos de microscopio	Fisher	12-550-15
SYCP3 anticuerpo	Abcam	ab205846	concentración de trabajo: 5 μ g/mL
TWEEN 20 (Polisorbato 20)	Sigma	P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)	Invitrogen	V35003
Baño