Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento y la amplificación de las bacterias conjuntivales anaerobias aeróbicas y facultativas del ratón usando una hisopo ocular única y un paso de enriquecimiento basado en la cultura con la identificación posterior por métodos basados microbiológicos y espectrometría de masas MALDI-TOF.
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Artículo de método
Aislamiento e identificación comensal conjuntival en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La superficie ocular era considerada una vez inmune privilegiada y abiótica, pero aparece recientemente que hay una presencia commensal pequeña, pero persistente. La identificación y la supervisión de las especies bacterianas en la mucosa ocular han sido desafiadoras debido a su abundancia baja y a la disponibilidad limitada de la metodología apropiada para el crecimiento y la identificación comensales. Hay dos enfoques estándar: métodos basados en el cultivo o métodos de secuenciación de ADN. El primer método es problemático debido a las bacterias recuperables limitadas y el segundo acercamiento identifica las bacterias vivas y muertas que llevan a una representación aberrante del espacio ocular. Desarrollamos un método robusto y sensible para el aislamiento bacteriano mediante el desarrollo de técnicas de cultivo microbiológico estándar. Esta es una técnica basada en hisopos, utilizando un hisopo delgado hecho "en el laboratorio" que se dirige a la conjuntiva inferior, seguido de un paso de amplificación para los géneros anaeróbicos aeróbicos y facultativos. Este protocolo nos ha permitido aislar e identificar especies conjuntivales como Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,etc. El enfoque es adecuado para definir la diversidad commensal en ratones bajo diferentes condiciones de enfermedad.
Introducción
El objetivo de este protocolo es aumentar el aislamiento específico de microbios anaeróbicos aeróbicos y facultativos viables y raros de la conjuntiva ocular para caracterizar el microbioma ocular. Amplios estudios han perfilado comunidades de la mucosa conmensal en la piel, intestino, vías respiratorias y genitales y muestran que estas comunidades influyen en el desarrollo del sistema inmune y la respuesta1,2,3. Se ha demostrado que las comunidades comensales oculares cambian durante ciertas patologías de la enfermedad, como la enfermedad del ojo seco4,
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran ratones siguen las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Siga las pautas de seguridad del laboratorio (según las indicaciones de su departamento institucional de salud y seguridad ambiental) cuando trabaje con microorganismos y materiales potencialmente contaminados. Utilice recipientes de desecho apropiados y procedimientos de descontaminación antes de la eliminación de materiales contaminados potencialmente peligrosos.
1. Preparación del hisopo ocular, configuración del campo de trabajo, hisopado de ojo de ratón y enriquecimiento de la muestra
- Preparar hisop....
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Resultados
Los resultados representativos de una placa de hisopo ocular que demuestran diferentes métodos para el revestimiento se muestran en la Figura 3A que muestra aislados morfológicamente diversos del ratón C57BL/6. Para cada aislante distinto, las colonias fueron contadas en la tira y la abundancia relativa, unidades formantes únicas de la colonia (CFUs) por la hisopo del ojo, calculadas y trazadas para los propósitos de la comparación. Para la caracterización microbiológica, las bacterias se se.......
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Discusión
Debido al estado paucibacteriano de la superficie ocular, muchos laboratorios han tenido dificultades para aislar los comensales oculares7,20,resultando en un bajo número de muestras con crecimiento, baja abundancia y baja diversidad8. Este método mejora significativamente las prácticas de cultivo estándar4,21 mediante la adición de un paso de enriquecimiento, así como un hisopo de.......
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Divulgaciones
No hay conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
El financiamiento de P30 DK034854 apoyó VY, LB y estudios en el Massachusetts Host-Microbiome Center y el financiamiento de NIH / NEI R01 EY022054 apoyó MG.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| de 0,1 a 10 y micro; l punta de pipeta | USA Scientific | 1110-300 | autoclave antes de usar |
| 0.5 a 10 y micro; l Pipeta Eppendorf | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| jeringa de 1 ml | Fisher Scientific | BD309623 | 1 jeringa para cada grupo de hisopo ocular |
| 1,5 ml tubos Eppendorf USA | Scientific | 1615-5500 | autoclave antes de usar |
| 1000 y micro; ml punta de pipeta | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave antes de usar |
| 200 a 1000µ l Pipeta Gilson (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| aguja de 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 aguja por grupo de hisopo |
| ocular 3 % Peróxido de hidrógeno | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubadora | Equipo | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Inyección (xilacina 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Kit de tinción | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Equipo | de laboratorio | ||
| Toallas de papel limpias | Laboratorio equipo | ||
| Algodón Batting/Algodón enrollado estéril | CVS | ||
| Desechable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | para pruebas de tinción de Gram y catalasa |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Portaobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 12-550-A3 | para pruebas de tinción de Gram y catalasa |
| Ketamina ( 100 mg / ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates Fisher | Scientific | 4321270 | tienda a 4 & grados; C hasta que esté listo para usar |
| Agar de sal de manitol | Carolina Biological Supply 784641 | Prepare los platos de acuerdo con las instrucciones de mfr, guárdelos a 4 & grados; C durante 1 semana | |
| Ratones | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | 08-757-12 | para manitol Placas de agar con sal RPI |
| Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | preparar de acuerdo con las instrucciones y autoclave |
| SteriFlip (0.22 y micro; m tamaño de poro sulfona de poliéster) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | para esterilizar la anestesia |
| Tubo de centrífuga Corning estéril | Fisher Scientific | 430829 | preparación de anestesia Jaula |
| ratón estéril | Equipo | ||
| de laboratorio Palillos de dientes (bambú redondo) | Autoclave Kitchen Essentials antes de | usar y preparación | |
| de hisoposAgar de Soja Tripticosa II con 5% de Placas de Sangre de Oveja | Fisher Scientific | 4321261 | tienda a 4 ° C hasta que esté listo para usar |
| Portaobjetos Vitek | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS Solución de matriz CHCA | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Gotas oftálmicas de un solo uso | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Gotas oftálmicas lubricantes, 28 viales, 0.02 onzas líquidas cada una |
Referencias
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science
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