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Artículo de método

Aislamiento de tejidos de alta pureza a partir de semillas de cebada en desarrollo

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DOI:

10.3791/61681

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26 de octubre de 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento manual de alta pureza y el control de calidad de tejidos maternos de embriones, endospermos y semillas durante todo el desarrollo de semillas de cebada.

Resumen

Comprender los mecanismos que regulan el desarrollo de las semillas de cereales es esencial para el mejoramiento de plantas y el aumento del rendimiento. Sin embargo, el análisis de las semillas de cereales es un desafío debido al tamaño diminuto, el carácter líquido de algunos tejidos y las estrechas conexiones entre tejidos. Aquí, demostramos un protocolo detallado para la disección del embrión, el endospermo y los tejidos maternos de la semilla en etapas tempranas, medias y tardías del desarrollo de la semilla de cebada. El protocolo se basa en una disección manual de tejidos utilizando herramientas de punta fina y un microscopio binocular, seguida de un control de pureza basado en el análisis de ploidía. Los tejidos maternos de las semillas y los embriones son diploides, mientras que el endospermo es tejido triploide. Esto permite la monitorización de la pureza de la muestra mediante citometría de flujo. Las mediciones adicionales revelaron la alta calidad del ARN aislado de dichas muestras y su utilidad para análisis de alta sensibilidad. En conclusión, este protocolo describe cómo diseccionar prácticamente tejidos puros de granos en desarrollo de cebada cultivada y, potencialmente, también de otros cereales.

Introducción

Las semillas son estructuras complejas compuestas por varios tejidos de origen materno y filial1. Los granos de cereales representan un tipo especial de semilla, y la mayor parte está formada por endospermo, un tejido triploide especializado que protege y nutre al embrión. Los cereales proporcionan alrededor del 60% de los recursos alimentarios mundiales y son el producto más valioso de la producción vegetal2. El conocimiento de los procesos moleculares que controlan el desarrollo de las semillas de cereales es importante debido a su prominencia económica y su papel central en la reproducción de las plantas 1,3.

La cebada cultivada (Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5,1 Gbp) es el cuarto cultivo de cereales más importante del mundo. Se utiliza para la alimentación animal, la alimentación y la biotecnología4. Además de eso, también es una especie modelo de cultivo de cereales de zona templada clásica de creciente importancia5. Los recursos genómicos de la cebada incluyen mapas genéticos, colecciones de cultivares, razas autóctonas y mutantes, ensamblajes y anotaciones de genomas de alta calidad, así como datos transcriptómicos de las principales etapas del desarrollo 5,6,7. Además, los genes de la cebada se utilizan para mejorar genéticamente otros cereales. La resistencia a estreses abióticos como la sequía y la salinidad, patógenos específicos y el alto contenido de compuestos beneficiosos (por ejemplo, β-glucano) hacen de la cebada una valiosa fuente de rasgos para el mejoramiento de trigo8.

El desarrollo de las semillas se inicia por la fertilización el día de la polinización (DOP). La DOP se define mediante la evaluación de la morfología del estigma y las anteras según la escala de Waddington (W10.0)9. Las espigas que contenían flores no polinizadas se caracterizaron por un estigma compacto (no ramificado) y anteras verdes, mientras que las espigas polinizadas contenían espigones extendidos, estigma extendido y ampliamente ramificado, óvulo hinchado, anteras abiertas y polen libre. Las flores en DOP representaron un fenotipo intermedio. Las anteras tenían un color amarillo, se rompían fácilmente y luego liberaban polen. El estigma tenía ramas sigmáticas del pistilo ampliamente extendidas (Figura 1C).

El desarrollo de la semilla de cebada incluye tres etapas parcialmente superpuestas 1,10. La etapa I (0 – 6 días después de la polinización; DAP) se inicia por doble fecundación, caracterizada por la proliferación celular y la ausencia de síntesis de almidón; la etapa II (7 – 20 DAP) comprende la diferenciación y una gran ganancia de biomasa acompañada de la producción de moléculas de almacenamiento de almidón y proteínas; el estadio III (después de 21 DAP) corresponde a la maduración de la semilla, la reducción de peso por desecación y el inicio de la latencia. Alternativamente, las fases se denominan temprana, media y tardía, respectivamente11.

El grano de cebada está cubierto por cáscaras, que consisten en la lema, la palea y las glumas12. En la mayoría de los genotipos de cebada, las cáscaras envuelven firmemente las semillas secas. La semilla en sí está formada por el embrión, el endospermo y los tejidos maternos de la semilla (Figura 1A). El embrión diploide se origina a partir de la fecundación del óvulo por el núcleo de un espermatozoide. En la semilla completamente desarrollada, el embrión consiste en el eje embrionario con la coleorriza que rodea la radícula, el coleóptilo que encierra el meristemo del brote y las hojas primarias, y el escutelo (cotiledón)1,10,13,14. El endospermo triploide es el resultado de la fecundación de la célula central diploide por el núcleo del segundo espermatozoide. La proliferación del endospermo comienza con la etapa sincitial (cenocitos), donde los núcleos en división son empujados hacia la periferia por la vacuola central. Al final de la fase sincitial, los microtúbulos forman una red radial alrededor de los núcleos e indican la formación de la pared celular anticlinal y el inicio de la celularización del endospermo. La diferenciación del endospermo ocurre simultáneamente con la celularización y da lugar a cinco tejidos principales: el endospermo almidonado, las células de transferencia, las capas de aleurona y subaleurona, y la región circundante del embrión. Los tejidos maternos de las semillas son una estructura diploide de múltiples capas de origen materno que contiene pericarpio y cubiertas de semillas10,12. Los tejidos maternos de las semillas incluyen una proyección nucelar en el lado dorsal del grano que tiene una función relacionada con el transporte, y se incrusta en el endospermo en etapas posteriores del desarrollo de la semilla15.

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Figura 1: Desarrollo de las semillas de cebada. (A) El dibujo esquemático del grano de cereal en el plano sagital con los tejidos maternos de la semilla (SMTs, verde), endospermo (END, amarillo), embrión (EMB, naranja) y cáscaras (H, gris). (B) Morfología de la espiga de cebada cerca de la antesis. Barra de escala = 1 cm. (C) Morfología del estigma y anteras en las etapas antes, durante y después de la polinización. El recuadro muestra el detalle del estigma con granos de polen (puntas de flecha). Barra de escala = 5 mm, barra de inserción = 200 μm. (D) Secciones sagitales y transversales de 4, 8, 16 y 24 semillas de DAP. (NP: proyección nucelar) Barra de escala = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los avances recientes en genómica de alto rendimiento proporcionan las herramientas para el estudio del desarrollo de tejidos de semillas individuales. Sin embargo, el mayor obstáculo de este propósito es la estructura compacta y la estrecha adherencia de los tejidos de la semilla1. Desarrollamos un protocolo para la disección de tejidos de semillas de alta pureza a partir de semillas de cebada en desarrollo con la posibilidad de su uso posterior para análisis altamente sensibles, como la secuenciación de ARN. Además, el protocolo presentado se puede adaptar fácilmente a otros cereales.

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Protocolo

1. Cultivo de plantas

NOTA: Teniendo en cuenta que una sola planta de cebada generalmente tiene de 5 a 6 macollos y solo se deben usar las 5 a 6 espiguillas del medio de cada espiga para la disección, entonces un rendimiento máximo por planta es de 72 semillas para cultivares de dos hileras y 216 semillas para cultivares de seis hileras.

  1. Para germinar semillas de cebada, prepare una placa de Petri acolchada con tres capas de papel de seda de celulosa cubierta con una capa de papel de filtro. Hidrátalo con agua destilada, para que no quede exceso de agua, pon las semillas en la superficie y cierra la placa de Petri. El papel de filtración evita el crecimiento de las raíces a través del tejido de celulosa. Germinar las semillas durante 3 días a 25 °C en la oscuridad.
    NOTA: Alternativamente, germine las semillas colocándolas directamente en una mezcla de tierra húmeda (consulte el paso 1.2).
  2. Transfiera las semillas germinadas con una radícula visible y un brote de unos 5 cm a macetas de turba de 5 cm x 5 cm con una mezcla de tierra y arena (3:1, v/v). Riegue regularmente. Después de 10 días, transfiera las plantas a macetas de 12 cm x 12 cm llenas de la misma mezcla de tierra.
  3. Cultive las plantas en una cámara climática bajo el régimen controlado de día largo (16 h día 20 °C, 8 h noche 16 °C; intensidad de luz 200 μmol m-2 s-1; humedad 60%).
    NOTA: La cebada de primavera requiere aproximadamente de 8 a 10 semanas desde la siembra hasta el comienzo de la antesis, sin requisito de vernalización. La cebada de invierno necesita 7-8 semanas de vernalización (condiciones de días cortos, 8 h al día 4 °C, 16 h de noche a 4 °C; intensidad de luz 200 μmol m-2 s-1; humedad 85%) para inducir la floración.

2. Determinación de la polinización

NOTA: Se necesita una determinación precisa de la polinización para una estimación adecuada de la progresión del desarrollo. La cebada es una especie que se autopolinia. Para definir el día de polinización (DOP), monitoreamos el día de autopolinización. Este rasgo es específico del cultivar, pero el inicio de la protuberancia de las aristas desde la vaina de la hoja es un buen indicador de que se aproxima la DOP (Figura 1B).

  1. Abra la vaina de la hoja que cubre la espiga. Use pinzas de punta fina para revisar las anteras y el ovario dentro de las espiguillas en la parte central de la espiga. Las espiguillas con anteras amarillas y estigma "esponjoso" polinizarán en pocas horas16 y se consideran DOP (Figura 1B).
  2. Corta la espiga cerca de la punta de la última espiguilla y retira la hoja bandera y la parte superior de los toldos. Luego, corte el 1/3 superior de los cascos en cada espiguilla. Esto seca las anteras y conduce a su apertura y liberación de polen más sincronizadas.
  3. Cubra la espiga con una bolsa de glassine con la identificación de la espiga, el número de planta y la fecha de DOP definida. Esto también evita la polinización cruzada, que puede comprometer experimentos específicos.
  4. Anote la información en un editor tabular. Utilice la siguiente fórmula para calcular el día después de la polinización (DAP) en el que se debe realizar el aislamiento del tejido.
    xDAP = DOP + x
    x = DAP esperado
    NOTA: Los valores deben tener el formato 'Datos'.
  5. Para la disección de los tejidos de las semillas, recoja las espigas en DAP de acuerdo con el calendario tabular preparado.

3. Disección de los tejidos de la semilla

NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse utilizando un microscopio estereoscópico. Retire las cáscaras antes de la disección con pinzas. Tenga en cuenta que los cascos se vuelven más secos y adherentes a partir de alrededor de los 16 DAP. Para mantener las condiciones fisiológicas y evitar el secado de los materiales vegetales durante la disección, humedezca las muestras poniéndolas en una gota de 1x PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 1,8 mM de KH2PO4, pH = 7,4). Utilice una nueva semilla para la disección de cada tejido para evitar la degradación del ADN, el ARN o las proteínas debido al tiempo prolongado de recolección de la muestra. Para el aislamiento de ARN a partir de material disecado, utilice únicamente materiales y productos químicos libres de ARNasa. No exceda el tiempo total de disección de 15 minutos para una muestra que consiste típicamente de tejidos disecados de 5 a 10 semillas para minimizar la degradación del ARN.

  1. Retire el resto de las cáscaras con pinzas de punta fina antes de la disección del tejido. Hidratar con 1× PBS durante 1 minuto ayuda a eliminar los residuos secos de la espiguilla.
  2. Coloque la semilla pelada en una placa de Petri con una gota de 1× PBS y diseccione las partes individuales con pinzas de punta fina, aguja fina y pipeta microcapilar. Se aplica una estrategia ligeramente diferente para la disección de tejidos individuales: los tejidos maternos de la semilla (paso 3.3), el embrión (paso 3.4) y el endospermo (paso 3.5).
  3. Disección de tejidos maternos de semillas
    1. Disección de semillas hasta 8 DAP
      1. Coloque una semilla en el lado dorsal y corte suavemente la semilla a lo largo de un eje longitudinal, y pele los tejidos maternos de la semilla, excepto la última capa que bordea el endospermo desde la parte apical hasta la basal, con pinzas.
      2. Recoja los tejidos maternos de las semillas de 5 a 10 semillas en un tubo de 1,5 mL con 50 μL de 1× PBS, deseche el tampón con una pipeta, enjuague el tejido dos veces con 100 μL de PBS, elimine el exceso de tampón pipeteando y cierre el tubo y congele en nitrógeno líquido o utilícelo directamente para la medición de ploidía por citometría de flujo. La cantidad de material es suficiente para una aplicación posterior (por ejemplo, aislamiento de ARN o medición de ploidía por citometría de flujo).
    2. Disección de semillas después de 8 DAP
      1. Coloque una semilla en el lado dorsal, córtela suavemente en el medio del lado ventral de los tejidos maternos de la semilla y retire gradualmente el tejido alrededor de la semilla entera, incluida la proyección nucelar. Para cada aplicación posterior, recoja y lave el tejido de 5 a 10 semillas como se describe en el paso 3.3.1.
  4. Disección del embrión
    1. Disección de semillas a los 8 DAP y menores
      1. Coloque una semilla en el lado dorsal y corte basal 1/3 de la semilla. Divida cuidadosamente la parte separada por la mitad y libere el embrión. Para cada aplicación posterior, recoja y lave los embriones de 10 a 20 semillas, como se describe en el punto 3.3.1.
    2. Disección de semillas después de 8 DAP
      1. Coloque una semilla en el lado dorsal y retire los tejidos maternos de la parte basal del lado ventral. Altere suavemente la capa delgada de endospermo alrededor del perímetro del embrión con una aguja fina o pinzas de punta fina y extraiga el embrión. Para cada aplicación posterior, recoja y lave los embriones de hasta 5 semillas, como se describe en el punto 3.3.1.
  5. Disección del endospermo
    1. Disección del endospermo sincitial de 4 semillas DAP.
      1. Coloque una semilla en el lado dorsal y retire los tejidos maternos de la semilla, excepto la última capa de células que bordean el endospermo. Punción suave de la capa en el centro de la cara ventral con una aguja fina y succión del endospermo sincitial por capilaridad con una pipeta microcapilar.
      2. Para cada aplicación posterior, recoja endospermos líquidos de 10 a 15 semillas en un nuevo tubo de 1,5 ml con tampón adecuado para el análisis posterior planificado (es decir, 1x PBS, tampón de aislamiento de ARN, tampón de citometría de flujo). El volumen del búfer debe reflejar el protocolo para la aplicación descendente planificada. Congelar en nitrógeno líquido.
    2. Disección de endospermo celulizante de 5 a 8 semillas DAP
      1. Coloque una semilla en el lado dorsal y retire todos los tejidos maternos y el embrión de la semilla. Para cada aplicación posterior, recoja y lave el endospermo de 10 a 15 semillas en un nuevo tubo de 1,5 ml con 1x PBS y congele en nitrógeno líquido.
    3. Disección de endospermo celularizado a partir de semilla después de 8 DAP
      1. Coloque una semilla en el lado dorsal, retire toda la semilla, los tejidos maternos y el embrión. Para cada aplicación posterior, recoja y lave el endospermo de una sola semilla por tubo, como se describe en el paso 3.3.1.
  6. Guarde los tubos con material aislado a -80 °C hasta su uso.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

4. Control de la pureza de los tejidos mediante citometría de flujo

NOTA: La pureza de la muestra se puede comprobar mediante citometría de flujo antes del aislamiento del ARN. La calibración adecuada del instrumento es fundamental para el análisis de muestras biológicas. La óptica del citómetro de flujo/analizador de ploidía debe ajustarse utilizando perlas de calibración (microesferas de poliestireno teñidas con fluorescencia muy uniformes con respecto a su tamaño e intensidad de fluorescencia) hasta la nitidez máxima del pico, que suele alcanzar el coeficiente de variación (CV) < 2%. Los tejidos de las semillas de cereales contienen principalmente poblaciones de núcleos G1, G2 y endoreduplicados; Por lo tanto, se recomienda utilizar una escala logarítmica. Comience con un tejido foliar que contenga principalmente núcleos G1 y sirva como control de la ploidía basal.

  1. Utilice muestras recién preparadas y mantenidas en hielo (véase el paso 3.3.1) o tejido congelado como se describe17.
    NOTA: Debido a que toda la muestra de DAP de < 8 se utiliza para la citometría de flujo, esto representa solo un control indirecto. Recomendamos a los investigadores que realicen múltiples aislamientos y mediciones hasta alcanzar una alta proporción de muestras puras (>90%) antes de proceder al aislamiento de ARN con < 8 muestras de DAP.
  2. Liberar los núcleos de las muestras de embriones DAP 4 y 8 (para otras muestras ver paso 4.4) homogeneizando los tejidos de 5 a 10 vueltas del mortero de plástico en un tubo de 1,5 mL que contiene 300 μL de tampón Otto I (0,1 M de ácido cítrico monohidratado, 0,5% (v/v) Tween 20, filtrado a través de un filtro de 0,22 μm)18.
  3. Filtrar la suspensión cruda a través de una malla de nylon de 50 μm en un tubo de análisis de citometría de flujo y añadir 600 μL de tampón Otto II (0,4 M Na2HPO4·12H2O) que contiene 2 μg mL-1 de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)18 para teñir el ADN.
  4. Coloque todos los demás tejidos (incluidos los 16 embriones DAP o superiores) en una placa de Petri que contenga 500 μL de tampón Otto I y homogeneice picando con una cuchilla de afeitar. Filtrar la suspensión como en el paso 4.3 y teñir con 1 mL de tampón Otto II que contenga DAPI.
    NOTA: La manipulación con una cuchilla de afeitar afilada de doble filo requiere una atención especial. Para reducir el riesgo de lesiones, hay hojas de afeitar de un solo filo o soportes de cuchillas especiales disponibles.
  5. Estimar el contenido de ADN nuclear de la muestra utilizando un citómetro de flujo. Se requieren al menos 2000 partículas por muestra para analizar la pureza de la muestra.

5. Aislamiento de ARN y medición de la calidad

  1. Utilice tejido congelado para evitar la degradación del ARN por las ribonucleasas endógenas. A partir de semillas, tejidos maternos y muestras de embriones, se aísla el ARN utilizando kits disponibles comercialmente o el reactivo TRIzol19. Debido al alto contenido de almidón en los tejidos del endospermo, aísle el ARN total de todas las muestras utilizando protocolos comerciales de extracción de ARN en columna para tejidos problemáticos (por ejemplo, Spectrum Plant Total RNA Kit) con un tratamiento con DNasa I en columna20.
  2. Mida la concentración y la integridad del ARN mediante un protocolo específico para la electroforesis en gel de ARN o el Bioanalyzer Agilent 2100.
    NOTA: El ARN total intacto tiene bandas/picos claros de ARNr 18S y 25S de alrededor de 1,9 y 3,7 kb respectivamente. La banda de ARNr 25S debe ser aproximadamente dos veces más intensa que la banda de ARNr 18S.

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Resultados

Para realizar un análisis transcriptómico específico de tejido del desarrollo de semillas de cebada, establecimos un protocolo para el aislamiento de tejidos de alta pureza. El protocolo se basa en la disección manual de tejidos maternos de embriones, endospermos y semillas a partir de granos pelados (después de la extracción manual de la cáscara) (Figura 1A). El protocolo se utilizó con éxito para aislar materiales de varios cultivares de cebada de primavera de dos y seis hileras, y las esp...

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Discusión

Aquí, presentamos un protocolo que permite el aislamiento de alta pureza de los tejidos de las semillas de cebada. Aunque fue desarrollado y probado para la cebada, puede ser fácilmente adoptado por otros miembros de la tribu Triticeae como el trigo, la avena, el centeno o el triticale27. La parte inicial del protocolo, que se centra en la disección del tejido de las semillas, no requiere ningún equipo no estándar o costoso y, por lo tanto, debería ser ac...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Jan Vrána y al Dr. Mahmoud Said por el mantenimiento de los citómetros de flujo, a Eva Jahnová por la preparación de los tampones, a Marie Seifertová por la lista de materiales y a Zdenka Bursová por el cuidado de las plantas. Este trabajo fue financiado principalmente por la subvención 18-12197S de la Fundación Checa para la Ciencia. A.P. recibió además el apoyo de la beca J. E. Purkyně de la Academia Checa de Ciencias y del proyecto FEDER "Las plantas como herramienta para el desarrollo global sostenible" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro de mmm 0,22MerckSLGSV255F
1,5 ml Eppendorf tuboSarstedt72.690.001
4',6-diamididno-2-fenilindolInvitrogenD21490
50 mmm malla de nylonSilk a Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BA
Conjunto de bombillasDrummond Scientific Company1-000-9000
Perlascalibración InvitrogenA16502
Papel
Ácido cítrico monohidratadoPenta13830-31000
Cámara climáticaWeiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
Filtro papelFagron
Pinzas de punta finaFine Science Tools11254-20
Citómetro de flujoSysmex-Partec
Tubo de citometría de flujoSarstedt55.484
Congelador
Bolsa
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
Nitrógeno líquidoLinde
Pipeta microcapilarFivephoton BiochemicalsMGM 1C-20-30
Pines MinutienFine Science Tools26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
Macetas de turbaJiffy5x5 cm
Placa
Soporte para alfileresFine Science Tools26016-12
Mortero de plásticop-Lab
Macetas12x12 cm
Hoja de afeitar Gillette
ARNasa zapInvitrogenAM9780
Tijeras de
Soil
Spectrum Plant Total RNA KitSigma AldrichSTRN50
Microscopio estereoscópicoOlympus
P2287
TRIzol reactivoInvitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513
de tisú de celulosade cristalde Petri A199001 arena Fine Science Tools 14060-11 Tween 20 Sigma Aldrich

Referencias

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