Aquí se presenta una técnica quirúrgica para trasplantar tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en el espacio subretiniano de un modelo animal grande.
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Artículo de método
Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las afecciones degenerativas de la retina (DR) asociadas con la pérdida de fotorreceptores, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la retinitis pigmentosa (RP) y la amaurosis congénita de Leber (LCA) causan pérdida de visión progresiva y debilitante. Existe una necesidad insatisfecha de terapias que puedan restaurar la visión una vez que se han perdido los fotorreceptores. El trasplante de tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) (organoides) en el espacio subretiniano de un ojo con RD avanzada aporta láminas de tejido retiniano con miles de fotorreceptores sanos libres de mutaciones y tiene el potencial de tratar la mayoría / todas las enfermedades cegadoras asociadas con la degeneración de los fotorreceptores con un protocolo aprobado. El trasplante de tejido retiniano fetal en el espacio subretiniano de modelos animales y personas con DR avanzada se ha desarrollado con éxito, pero no se puede utilizar como tratamiento de rutina debido a preocupaciones éticas y suministro limitado de tejido. Los modelos animales de degeneración retiniana hereditaria (IRD) del ojo grande son valiosos para desarrollar terapias de restauración de la visión que utilizan enfoques quirúrgicos avanzados para trasplantar células / tejidos de la retina en el espacio subretiniano. Las similitudes en el tamaño del globo y la distribución de los fotorreceptores (por ejemplo, la presencia de área central de la región similar a la mácula) y la disponibilidad de modelos IRD que recapitulan estrechamente el IRD humano facilitarían la traducción rápida de una terapia prometedora a la clínica. Aquí se presenta una técnica quirúrgica de trasplante de tejido retiniano derivado de hPSC en el espacio subretiniano de un modelo animal grande que permite la evaluación de este enfoque prometedor en modelos animales.
Introducción
Millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la degeneración de la retina (DR) con la consiguiente discapacidad visual o ceguera asociada con la pérdida de los fotorreceptores sensibles a la luz (PR). La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es una causa importante de ceguera como resultado de una combinación de factores de riesgo genéticos y factores ambientales / de estilo de vida. Además, se ha encontrado que más de 200 genes y loci causan DR hereditaria (IRD)1. La retinitis pigmentosa (RP), el IRD más común, es genéticamente heterogénea con más de 3.000 mutaciones genéticas en aproximadamente 70 genes que se han<....
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Protocolo
Los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. También fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan. En este estudio se utilizaron gatos de tipo salvaje y CrxRdy/+ de una colonia de gatos mantenida en la Universidad Estatal de Michigan. Los animales fueron alojados en ciclos de luz-oscuridad de 12 h y alimentados con una dieta comercial completa para gatos.
1. Procedimientos preimplant....
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Resultados
Este procedimiento permite la implantación exitosa y reproducible de organoides retinianos derivados de hPSC en el espacio subretiniano de un modelo animal de ojo grande (demostrado aquí usando 2 ejemplos: gatos salvajes con fotorreceptores sanos (PR) y gatos CrxRdy/+ con PRs y retina degenerados). Siguiendo los pasos indicados en la Figura 1 , prepare y cargue los organoides retinianos derivados de hPSC en la cánula de vidrio de borosilicato del dispositivo de i.......
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Discusión
La implantación de tejido retiniano derivado de hPSC (organoides retinianos) en el espacio subretiniano es un enfoque experimental prometedor para restaurar la visión de las enfermedades degenerativas de la retina en etapa tardía causadas por la muerte celular PR (ceguera profunda o terminal). El enfoque presentado se basa en una terapia experimental desarrollada y probada con éxito basada en el injerto subretiniano de un pedazo de tejido retiniano fetal humano23,24,25.......
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Divulgaciones
Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., e Igor O. Nasonkin Ph.D. son empleados de Lineage Cell Therapeutics, Inc. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por NEI Fast-track SBIR grant R44-EY027654-01A1 y SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones es un co-PI). Janice Querubin (MSU RATTS) por su ayuda con la anestesia y el cuidado general de los animales incluidos en este estudio, así como la ayuda con el entorno quirúrgico y la preparación / esterilización de instrumentos. Paige Winkler por la ayuda en recibir los organoides y colocarlos en los medios el día anterior a la implantación y por la ayuda el día de la implantación. Los autores también agradecen al Sr. Randy (LCTX) por el envío diligente de los org....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; El filtro de jeringa de poro m con membrana PES | Cameo | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| inyector subretiniano de 23G con cánula extensible de 41 G | DORC | 1270.EXT | |
| 250 y micro; L jeringa de bloqueo luer hermética al gas | Hamilton | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| 6-0 Sutura de seda | Ethicon | 707G | |
| 6-0/7-0 sutura de poliglactina | Ethicon | J570G | |
| Maleato de acepromazina 500 mg / 5 mL (Aceproject) | Henry Schein Animal Health | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Buprenorfina 0.3 mg / | mL Par Pharmaceutical | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| cSLO + SD-OCT | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+ OCT | |
| Cyclosporine | Novartis | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Dexametasona 2 mg / mL (Azium) | Vetone | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Doxycyline 25 mg / 5 mL | Cipla | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Solución Fatal Plus (solución de pentobarbital) | Vortech | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Gentamicina 20 mg / 2 ml | Hospira | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Capilar de vidrio (Borosilicato estándar de un solo barril de pared delgada (Schott Duran) Tubos de vidrio | World Precision Instruments | TW150-4 | |
| Metilprednisolona actetato 40 mg/mL | Pfizer | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Microscopio | Zeiss | NA | |
| OCT medio (Tissue-Tek O.C.T. Compound) | Sakura | 4583 | |
| Olympic Vac-Pac Size 23 | Natus | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Paraformaldehído 16% solución | EMS | 15719 | |
| Clorhidrato de fenilefrina 10% solución oftálmica | Akorn | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Prednisolona 15 mg / 5 ml | Akorn | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Propofol 500 mg / 50 ml (10 mg / mL) (PropoFlo28) | Zoetis | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Cámara de fondo de ojo de video RetCam II | Clarity Medical Systems | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Triamcinolona 400 mg / 10 mL (Kenalog-40) | Bristol -Myers Squibb Company | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Tropicamide 1% solución oftálmica | Akorn | NA | se puede encontrar a través de varios proveedores |
| Puerto de vitrectomía 23G | Sistemas Alcon | Accurus | |
| Máquina de vitrectomía | Sistemas Alcon | Accurus | |
| Tijera vitreo-retiniana vertical de 80 grados con mango de compresión | Frimen | FT170206T |
Referencias
- Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
- Dias, M. F., et al.
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Reimpresiones y permisos
