Artículo de método

Determinación del tamaño y análisis fenotípico de vesículas extracelulares urinarias mediante citometría de flujo

DOI:

10.3791/61695

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23 de abril de 2021

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1Red de Apoyo a la Investigación, Universidad Nacional Autónoma de México e Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, 2Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método para el aislamiento de vesículas extracelulares urinarias, uEVs, de donantes humanos sanos y su caracterización fenotípica por el tamaño y la expresión de marcadores de superficie mediante citometría de flujo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las vesículas extracelulares, EV, son un complejo heterogéneo de membranas lipídicas, secretadas por cualquier tipo de célula, en cualquier fluido como la orina. Los VE pueden ser de diferentes tamaños, desde 40-100 nm de diámetro, como en los exosomas, hasta 100-1000 nm en las microvesículas. También pueden contener diferentes moléculas que pueden ser utilizadas como biomarcadores para el pronóstico y diagnóstico de muchas enfermedades. Se han desarrollado muchas técnicas para caracterizar estas vesículas. Una de ellas es la citometría de flujo. Sin embargo, no existen informes que muestren cómo cuantificar la concentración de VE y diferenciarlos por tamaño, junto con la detección de biomarcadores. Este trabajo tiene como objetivo describir un procedimiento para el aislamiento, cuantificación y fenotipificación de vesículas extracelulares urinarias, uEVs, utilizando un citómetro convencional para el análisis sin ninguna modificación en su configuración. Las limitaciones del método incluyen la tinción de un máximo de cuatro biomarcadores diferentes por muestra. El método también está limitado por la cantidad de EV disponibles en la muestra. A pesar de estas limitaciones, con este protocolo y su posterior análisis, podemos obtener más información sobre el enriquecimiento de los marcadores de VE y la abundancia de estas vesículas presentes en las muestras de orina, en enfermedades que implican daño renal y cerebral.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los mamíferos, la sangre se filtra pasando por los riñones de 250 a 300 veces; Durante este tiempo, se forma la orina. La producción de este biofluido es el resultado de una serie de procesos, que incluyen la filtración glomerular, la reabsorción tubular y la secreción. Los productos de desecho metabólicos y los electrolitos son los principales componentes de la orina. Además, se excretan otros subproductos como péptidos, proteínas funcionales y vesículas extracelulares (VE) 1,2,3,4,5,6. Inicialmente, se identificaron vesículas extracelulares urinarias (uEV) en muestras de orina de pacientes que padecían trastornos del equilibrio hídrico. Estos pacientes mostraron la presencia de moléculas como la acuaporina-2 (AQP2), que luego fue utilizada como biomarcador de esta enfermedad7. Varios estudios posteriores se centraron en identificar el origen celular de los uEVs, describiendo que estas estructuras pueden ser secretadas por células renales (glomérulos, podocitos, etc.) y otros tipos celulares de linajes endoteliales o leucocitarios. Además, el número y el enriquecimiento de moléculas en los uEV pueden correlacionarse con el estado de muchas enfermedades y trastornos 8,9,10,11,12,13,14.

En conjunto, los EV forman una familia muy heterogénea de partículas encerradas por bicapas lipídicas y liberadas por las células a través de mecanismos pasivos o activos en diferentes fluidos. Dependiendo de su origen, los VE pueden clasificarse como exosomas originados por endosomas o microvesículas/micropartículas derivadas de la membrana plasmática. Sin embargo, este criterio de clasificación solo se puede aplicar cuando se observa directamente la biogénesis de las partículas. Por lo tanto, otros criterios no triviales, como el origen físico, bioquímico y celular, han sido avalados por varios investigadores en el campo 15,16,17. Dependiendo de la naturaleza del aislado analizado, se sugirieron diferentes técnicas analíticas para la caracterización de las VE. Por ejemplo, sobre la base del enriquecimiento de EV grandes (≥100 nm) o pequeños (≤100 nm), se sugiere la cuantificación mediante citometría de flujo o seguimiento de nanopartículas, respectivamente18.

Hoy en día, el uso de los VE como biomarcadores de muchas enfermedades ha cobrado relevancia, por lo que se está investigando la búsqueda de diferentes fuentes. Una de las fuentes más prometedoras es la orina, ya que se puede obtener de forma fácil y no invasiva. Por lo tanto, este protocolo describe un procedimiento para el aislamiento de uEVs por centrifugación diferencial, procesamiento con anticuerpos conjugados con fluorocromo y análisis posterior utilizando un citómetro convencional de 2 láseres/4 colores.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las muestras de orina humana se obtuvieron de voluntarios sanos que habían firmado el consentimiento informado del donante. Estos procedimientos también fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán.

1. Aislamiento de vesículas extracelulares urinarias

NOTA: El protocolo de aislamiento de los uEVs se modifica de la ref.19. La Figura 1 muestra la representación del protocolo para aislar los uEV.

figure-protocol-1
Figura 1: Descripción general del aislamiento de uEVs para el análisis de citometría de flujo. En este protocolo, primero centrifuga la primera orina del día para eliminar las células y los desechos. A continuación, centrifugar para eliminar las vesículas grandes con un tratamiento para eliminar la proteína THP y, por último, realizar la ultracentrifugación para enriquecer y obtener los uEV con un solo lavado. Se marcan los pasos para conservar las fracciones de orina para la validación de los WB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Use la primera orina de la mañana (15 ml) de voluntarios sanos. Centrifugar la orina a 3.000 x g durante 10 min a 4 °C, para eliminar todas las células y residuos.
    NOTA: Utilizar preferentemente orina fresca; si no está disponible, utilice la orina almacenada durante un período máximo de 3 meses a -20 °C, o almacenada durante un período máximo de 6 meses a -70 °C. Descongele la muestra de orina en hielo y vórtela vigorosamente. Realice todos los procedimientos en hielo o a 4 °C. Un paso opcional para el análisis de Western blot es hacer un tubo duplicado y una alícuota de 200 μL de la orina de la primera mañana en un tubo separado. Almacene la muestra a -20 °C hasta su uso, etiquetándola como "orina entera", para comprobar si hay marcadores de vesículas extracelulares.
  2. Transfiera el sobrenadante obtenido en el paso 1.1 a un nuevo tubo de centrífuga cónico de 15 mL y, a continuación, centrifugar a 10.000 x g durante 45 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de ultracentrifugación de policarbonato de 8 mL y consérvelo en hielo.
    NOTA: Opcionalmente, alícuota 200 μL del sobrenadante obtenido en el paso 1.1 en un tubo separado etiquetado como "orina sin células" para el análisis de Western blot.
    1. Eliminación de la proteína Tamm-Horsfall, THP
      NOTA: El THP está presente en la orina y se enriquece cuando un individuo tiene enfermedad renal. Se ha informado de que el THP disminuye el rendimiento de los uEV porque puede unirse a los uEV. Para eliminar esta proteína, es necesario el uso de un agente reductor 3,6.
      1. Prepare la solución de aislamiento mezclando 250 mM de sacarosa con 10 mM de trietanolamina. Ajusta el pH a 7,6.
      2. Mezclar el pellet obtenido en el paso 1.2 con 500 μL de solución aislante y, a continuación, añadir 5 μL de β-mercaptoetanol.
      3. Incubar la mezcla de pellets a 37 °C durante 10 min, vórtice cada 2 min. Añadir 500 μL de solución aislante y centrifugar a 17.000 x g durante 10 min a 37 °C. Recoja el sobrenadante obtenido (que contiene THP reducido-no agregado más uEVs).
  3. Mezclar los sobrenadantes reservados (de los pasos 1.2 y 1.2.1.3) en el mismo tubo de ultracentrifugación de policarbonato de 8 mL y, a continuación, centrifugar a 160.000 x g durante 70 min a 4 °C, utilizando un rotor de ángulo fijo de ultracentrífuga.
    NOTA: Opcionalmente, para el análisis de Western blot, almacene 200 μL del sobrenadante obtenido anteriormente etiquetándolo como "sobrenadante sin EV". Esta muestra servirá como control negativo en la búsqueda de marcadores de vesículas extracelulares.
  4. Deseche el sobrenadante. Añada 1x PBS helado al tubo de policarbonato de 8 ml y centrifugar a 160.000 x g durante 70 min a 4 °C.
    NOTA: Tenga cuidado de no desechar el pellet, ya que contiene los uEV. El 1x PBS debe esterilizarse y filtrarse con un filtro de jeringa de poro de al menos 0,22 μm.
  5. Deseche el sobrenadante. Añadir el resto del sobrenadante al tubo de policarbonato de 8 mL y centrifugar a 160.000 x g durante 70 min a 4 °C.
  6. Deseche el sobrenadante y agregue 8 mL de PBS helado al pellet para lavar los uEV.
  7. Deseche el sobrenadante. Deje secar el pellet y luego vuelva a suspenderlo con 1 mL de PBS helado. Conservar a -70 °C hasta su uso.
    NOTA: Si realiza un análisis de Western blot, vuelva a suspender el pellet del tubo duplicado con 50 μL de tampón RIPA más inhibidores de la proteasa. Conservar a -20 °C hasta su uso.

2. Tinción de uEVs

NOTA: Antes de la tinción y el análisis de los uEV, es esencial realizar al menos una metodología recomendada por MISEV201818 para verificar el aislamiento adecuado de los uEV; aquí, se representa el análisis de Western blot. La Figura 2 muestra un protocolo representativo para la tinción de uEVs.

figure-protocol-2
Figura 2: Descripción general de la tinción y captura de uEVs en el citómetro. (A) Representación de la tinción de uEV. Durante 500.000 uEVs, el anticuerpo se mezcló e incubó a 4 °C durante 12 h. Luego se añadió CFSE y se incubó a 37 °C durante 10 min. Los uEV tenían el CFSE en su interior, y el anticuerpo se unirá a la superficie del antígeno. Se utilizaron 400 μL de PBS frío para resuspender y capturar 100 μL de la muestra en el citómetro de flujo a baja velocidad. B) Estrategia de análisis. El primer diagrama de puntos (SSC-H VS FL-X) muestra el control negativo para los uEVs, seguido por el diagrama de puntos que muestra los uEVs teñidos con CFSE, y finalmente, un histograma con la tinción de anticuerpos de los uEVs (línea negra), el control negativo se muestra en la línea de grises. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Calcule el número relativo de uEV cuantificando el contenido de proteínas utilizando cualquier ensayo colorimétrico convencional de proteínas, como se menciona en la Tabla de Materiales. Realice una dilución 1:5 de los uEV y siga las instrucciones de la hoja de datos proporcionada en el kit de proteínas de ensayo.
  2. Con base en una fórmula20 reportada anteriormente, considere que 1 μg/mL de proteína uEVs es igual a 800,000 uEVs/μL. Asegúrese de que 500,000 uEVs estén presentes en 20 μL de PBS helado.
  3. Etiquete los tubos, como se indica en la Tabla 1.
    NOTA: El número de tubos utilizados dependerá del número de anticuerpos empleados, la limitación para el citómetro de 2 láseres/4 colores es un máximo de 4 anticuerpos por tubo que se podrían utilizar; por lo tanto, solo se pudieron leer FL1, FL2, FL3 y FL4 en el citómetro, aunque se necesita compensación. Para estos procedimientos, utilice tubos de microcentrífuga de 1,5 mL o tubos de fondo redondo de 5 mL para citometría de flujo. Los tubos necesarios se muestran en la Tabla 1. Los tubos 4 y 5 consisten en un cóctel de todos los anticuerpos que se utilizarán en este protocolo. A modo de ejemplo, se dan dos tubos problemáticos (8 y 9); Por lo tanto, este conjunto de controles debe tener la combinación que se va a utilizar en cada tubo.
Tubo 1.Perlas Megamix FSC
Tubo 2.PBS
Tubo 3.PBS con CFSE
Tubo 4.PBS con todos los anticuerpos del problema 1
Tubo 5.PBS con todos los anticuerpos del problema 2
Tubo 6.Control de autofluorescenciauEVs sin ningún reactivo, solo en PBS.
Tubo 7.#uEVsuEVs con CFSE
Tubo 8.Problema 1uEV con CD37 FITC, CD53 PE, ADAM10 APC
Tubo 9.Problema 2uEVs con CD9 FITC, TSPAN33 APC

Tabla 1: Etiquetado de tubos. Ejemplo que muestra cómo etiquetar los tubos. Los primeros tubos son todos los controles necesarios. Los tubos con los anticuerpos-fluorocromos dependerán de la tinción.

  1. Añada 20 μL de PBS que contenga 500.000 uEV a los tubos etiquetados.
  2. Añadir los anticuerpos como se indica en la Tabla 1, previamente titulada. Incubar durante la noche a 4 °C.
    NOTA: Antes de la tinción, se recomienda centrifugar los anticuerpos a 4 °C a toda velocidad durante al menos 5 min, para evitar los agregados. Los anticuerpos utilizados aquí son un ejemplo de proteínas presentes en los uEVs y pertenecen a un manuscrito independiente actualmente en preparación.
  3. Añadir 0,4 μL de éster succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) [5 nM] al tubo número 3. Incubar durante 10 min a 37 °C.
    NOTA: El CFSE es un tinte que se utiliza para teñir todos los EV presentes en una muestra y discriminar entre el ruido de fondo cuando se realiza un análisis de citómetro de flujo. Para obtener más información, consulte la sección Discusión .
  4. Agregue 400 μL de PBS 1x helado a todos los tubos.
  5. Mantenga todos los tubos a 4 °C.

3. Adquisición de uEVs utilizando un citómetro convencional

NOTA: Las instrucciones para el uso del citómetro de flujo (consulte la Tabla de materiales) se describen aquí.

  1. Realice la calibración de calidad del citómetro, utilizando las perlas de 6 y 8 picos.
    NOTA: El %CV del último pico debe ser un valor inferior a 6; El técnico del citómetro se encargará de esto.
  2. Abra el software del citómetro de flujo.
    NOTA: Una vez que se abra el software, se abrirá un nuevo experimento, que muestra una pantalla con una plantilla para 96 muestras, los parámetros para ejecutar y una sección "vacía" para crear diagramas de puntos o histogramas.
  3. Ajuste los parámetros en la pantalla del software que se está ejecutando: 100 μL de muestra para capturar, funcionamiento lento, establezca el umbral en 10.000 en FSC-H y 2.000 en SSC-H.
    NOTA: El umbral recomendado aquí es un ejemplo; Es necesario establecer el umbral en función de las muestras analizadas.
  4. Tubo de carga número 1 (tubo Megamix), como se indica en la Tabla 1. Captura las cuentas. Cree dos diagramas de puntos en la parte "vacía" de la pantalla del software haciendo clic en la opción Diagrama de puntos . Créelo como panel A y B de la Figura 3.
    NOTA: Las perlas fluorescentes Megamix (perlas utilizadas para delimitar los tamaños de 0,1, 0,3, 0,5 y 0,9 μm y crear la plantilla para los tamaños), se pueden analizar utilizando el detector FL1 (FITC). Todos los diagramas de puntos e histogramas deben mostrarse en valores de altura. Registre tantos eventos como sea posible; Cualquier modificación en la hoja de trabajo no altera los datos.

figure-protocol-3
Figura 3: Diagramas de puntos de cuentas Megamix FSC. Los diagramas de puntos mostrados se generaron utilizando el software de citómetro de flujo; En el citómetro de flujo, la imagen será muy similar. (A) El primer diagrama de puntos generado para seleccionar las cuentas evitando el ruido de fondo. (SSC-H VS FL1-H). (B) El diagrama de puntos generado por la selección de la puerta anterior, que muestra los diferentes tamaños de las cuentas. (SSC-H VS FSC-H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. En la sección "vacía" de la pantalla del software, cree un diagrama de puntos y un histograma para cada fluorocromo utilizado; utilice el algoritmo de la Figura complementaria 1 como ejemplo. Para hacer esto, haga clic en la opción Diagrama de puntos o Histograma para cada fluorocromo.
    NOTA: El ruido de fondo siempre estará presente, como se muestra en la Figura 3A. Todos los puntos entre 0 y 1.000 de FL1 (eje x) están fuera de la puerta creada. Por lo tanto, es fundamental utilizar todos los tubos de control para obtener resultados adecuados. Entre cada carga del tubo, lave a contrapelo el líquido de la vaina y realice un ciclo de desobstrucción. Agite suavemente cada tubo antes de cargarlo. Después de cargar cinco tubos consecutivos, ejecute 100 μL de PBS 1x.
  2. Cargue los tubos número 2 y 5, para establecer los valores de corte (negativos). Para ello, seleccione el icono Puerta rectangular (situado debajo del diagrama de puntos creado) o el icono Puerta de línea (situado debajo del histograma creado); y colóquelo donde no haya señal, con el fin de obtener diagramas de puntos e histogramas como los que se muestran en la Figura Suplementaria 1.
    NOTA: Todos estos tubos requieren la colocación de la región positiva no más allá del 0,70% porque no habrá "fluorescencia" superior a 103 (1.500). Si hay alguna fluorescencia más allá de esta región, diluya los reactivos utilizados. Por lo tanto, es importante valorar los reactivos antes de las mediciones finales.
  3. Cargue el tubo número 6 (tubo de autofluorescencia), para establecer las regiones negativas de la muestra. Para ello, seleccione el icono Puerta rectangular (situado debajo del diagrama de puntos creado) o el icono Puerta de línea (situado debajo del histograma creado); Colócalo donde no haya señal.
  4. Cargue los siguientes tubos (tubos 7 a 9, representados en la Tabla 1).
  5. Guarde el experimento.
    NOTA: Para el software del citómetro utilizado aquí, el comando Guardar experimento, se refiere a guardar los datos generados. En otras palabras, todos los tubos que son adquiridos por el citómetro de flujo, y los datos generados para cada tubo, deben guardarse. Para ello, es necesario hacer clic en el botón Guardar experimento .
  6. Exporte datos como archivos FSC.

4. Análisis de los datos con un software de citómetro de flujo.

NOTA: Las instrucciones para usar el software del citómetro de flujo que se muestra en la tabla de materiales se describen en esta sección. En la figura 4 se muestra el espacio de trabajo con los pasos para crear las puertas de tamaño.

figure-protocol-4
Figura 4: Espacio de trabajo con todos los pasos para comenzar el análisis de los datos. Todas las imágenes fueron generadas mediante serigrafía del espacio de trabajo. (A) Espacio de trabajo generado con los datos de muestra agregados (izquierda), diagrama de puntos generado por la selección del tubo 1, perlas FSC, (derecha). (B,C) muestran la modificación del eje, para tener SSC-H y FSC-H. (D-F) muestran la personalización paso a paso de ambos ejes. (G-I) muestran la selección y generación de los diferentes tamaños de cuentas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Abra el software del citómetro de flujo. Agregue las muestras, haciendo clic en el botón Agregar muestras , y seleccione los archivos FCS exportados.
  2. Haga clic en el tubo Megamix para abrir un diagrama de puntos SSC-H (eje y) VS FSC-H (eje x). Ajuste ambos ejes para ver de 0 a 100.000 haciendo clic en el botón T (Transformar visualización de datos), haga clic en Personalizar eje, haga clic en SSC-H o FSSC-H y cambie el valor de la escala a min 0 y max 100,000 (consulte la Figura 4A-F).
  3. Establezca las puertas para 0,1, 0,3, 0,5 y 0,9 μm, en el diagrama de puntos generado en el paso 4.2. Seleccione el botón Puerta rectangular para crear una puerta como se muestra en la Figura 4G-I.
    NOTA: La Figura 5 muestra el espacio de trabajo con los pasos para crear las regiones positivas y obtener la intensidad media del fluorocromo.

figure-protocol-5
Figura 5: Espacio de trabajo para analizar los datos obtenidos. Todas las imágenes fueron generadas por la serigrafía del espacio de trabajo. (A) Espacio de trabajo generado con la puerta de tamaño aplicada a todas las muestras. (B) Tubo de autofluorescencia seleccionado, diagrama de puntos que muestra la puerta de tamaño y el histograma para un tamaño seleccionado (0,1 μm), use este histograma para obtener la puerta positiva para cada fluorocromo y tamaño. (C) Espacio de trabajo generado con las puertas positivas para cada fluorocromo y tamaño. (D) Espacio de trabajo (izquierda) y Editor de diseño (derecha) generados para las muestras. En el Editor de Layout se muestra el histograma para el tubo de autofluorescencia y el tubo positivo para FL1-H, y cómo obtener el panel de propiedades para modificarlos. (E) La imagen muestra cómo obtener el valor de fluorescencia de intensidad media. (F) Histogramas generados para tres fluorocromos diferentes, mostrando todos los cambios que el software permite hacer con la información estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Aplique las puertas generadas (0,1, 0,3, 0,5 y 0,9 μm) a todas las muestras. Seleccione las Puertas, arrastre y suelte en la opción Todas las muestras , como se muestra en la Figura 5A.
  2. Haga clic en el tubo de autofluorescencia. Establezca las regiones positivas para cada fluorocromo, para cada tamaño. Abra el diagrama de puntos SSC-H VS FSC-H con las puertas de tamaño, haga clic en Tamaño de puerta única. En la nueva ventana, haga clic en el eje Y para seleccionar la opción de histograma. En el eje x, seleccione FL1-H y, a continuación, seleccione el icono Rango para crear la región positiva. Repita la operación para FL2-H y FL4-H (consulte la figura 5B).
  3. Aplique las puertas a todas las muestras. Seleccione Puertas, arrastre y suelte en la opción Todas las muestras , como se muestra en la Figura 5C.
  4. Abra el editor de diseño.
  5. Arrastra y suelta cada muestra en el editor. Seleccione el tamaño del tubo de "autofluorescencia", arrastre y suelte, luego seleccione el mismo tamaño del tubo teñido, arrastre y suelte.
  6. Haga clic en la parte inferior derecha del histograma. Abra el menú Propiedades . Haga clic en Leyenda. Agregue la intensidad media del fluorocromo.
    NOTA: En Propiedades, hay otras herramientas disponibles para modificar la apariencia del histograma.
  7. Repita el mismo procedimiento para los fluorocromos y tamaños restantes.

5. Análisis para obtener el número de uEVs por muestra.

NOTA: En la Figura 6 se muestra el espacio de trabajo con los pasos para obtener el número de uEV por muestra.

figure-protocol-6
Figura 6: Espacio de trabajo para analizar el tubo CFSE. Todas las imágenes fueron generadas mediante serigrafía del espacio de trabajo. (A) Espacio de trabajo generado por la selección de todos los tamaños de la región, uEVs totales (izquierda), diagrama de puntos que muestra la puerta seleccionada (derecha). (B) Diagrama de puntos SSC-H VS FL1-H para la región negativa de CFSE en el tubo de autofluorescencia. (C) Diagrama de puntos SSC-H VS FL1-H para CFSE en el tubo de tinción. (D) Imagen de la tabla obtenida con los estadísticos de la tinción de CFSE, mostrando el número de uEVs en la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Haga clic en Tubo de autofluorescencia. En el diagrama de puntos SSC-H VS FSC-H con las puertas de tamaño, cree una región que incluya todos los tamaños. Haga clic en Nueva región. Establezca la región positiva (consulte la figura 6A,B).
  2. Aplique las puertas a todas las muestras. Seleccione las puertas, arrastre y suelte en la opción Todas las muestras .
  3. Haga clic en el tubo CFSE + uEVs. Abra la nueva región y verifique la región positiva para CFSE (FL1-H), como se muestra en la figura 6C.
  4. En el espacio de trabajo de la Figura 6D, copie los datos de las celdas # para el tubo. Este número es el #uEVs obtenido por citometría de flujo (#uEVs FC).
  5. Aplica la siguiente fórmula para calcular el número de uEV por microlitro:
    figure-protocol-7
  6. Para tener el #uEVs por microlitro para cada fluorocromo (#uEVs/μL FLX), en el espacio de trabajo, copie las estadísticas para el subconjunto FLX-H, este número es el porcentaje (subconjunto %FLX).
  7. Aplique la siguiente fórmula para calcular el número de uEV por microlitro para cada fluorocromo.
    figure-protocol-8
    NOTA: Dependiendo de si la puerta seleccionada será para un tamaño o para todos los uEV, verifique los datos seleccionados.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hay varios puntos de control a través del protocolo, y antes de la tinción de los uEVs. Por lo tanto, es esencial verificar primero la cantidad de proteína presente en el extracto de uEV. Todos los grupos de investigación que trabajan con vesículas extracelulares cuantifican la proteína, tal y como se indica en el paso 2.1. La Figura 2 suplementaria muestra una placa representativa de 96 pocillos que contiene fracción de uEVs en los pozos 4E, 5E y 6E. Los pozos 1A, 2A y 3A consisten en espacios en blanco...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la actualidad, se ha incrementado el uso de vesículas extracelulares como biomarcadores de diversas enfermedades, especialmente de aquellas que pueden aislarse de fuentes no invasivas como la orina 5,21,22,23,24. Se ha comprobado que el aislamiento de los vehículos monoclonales es un recurso vital para conocer el estado de ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación financiera o comercial que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de becas del CONACyT (A3-S-36875) y del Programa UNAM-DGAPA-PAPIIT (IN213020 y IA202318). NH-I contó con el apoyo de la beca 587790 del CONACyT.

Los autores quieren agradecer a Leopoldo Flores-Romo†, Vianney Ortiz-Navarrete, Antony Boucard Jr y Diana Gómez-Martin por sus valiosos consejos para la realización de este protocolo, y a todas las personas sanas por sus muestras de orina.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo APC anti humano CD156c (ADAM10)BioLegend352706Add 5 µ L a la 20 µ L de uEVs en el
anticuerpo anti TSPAN33 humano (BAAM) PBS APCBioLegend395406Add 5 µ L a la 20 µ L de uEVs en PBS
Centrífuga Avanti con rotor de ángulo fijo JA-25.5OBeckamn CoulterJ-26S XPI
BD Citómetro de flujo Accuri C6BD Biosciences
β-mercaptoetanolSIGMA-AldrichM3148
Centrífuga de sobremesa con rotor A-4-44Eppendorf5804
BLUEstain 2 escalera de proteínasGOLDBIOP008
CD9 (C-4) anticuerpo monoclonal de ratónSanta Cruz Biotechnologysc-13118
CD63 (MX-49.129.5) anticuerpo monoclonal de ratónSanta Cruz Biotechnologysc-5275
Cell Trace CFSE kit de proliferación celular para citometría de flujoThermo ScientificC34554
Sistema Chemidoc XRS+BIORAD5837
FITC anti anticuerpo CD9 humanoBioLegend 312104Add 5 µ L a la 20 µ L de uEVs en PBS
FITC anti anti humano CD37 anticuerpo BioLegend356304Add 5 µ L a la 20 µ L de uEVs en PBS
Partículas amarillas fluorescentesSpherotechFP-0252-2
Partículas amarillas fluorescentesSpherotechFP-0552-2
Partículas amarillas fluorescentesSpherotechFP-1552-2
FlowJo SoftwareBecton, Dickinson and Company
Inmunoglobulinas anti-ratón goat/HRPDakoP0447
Cóctel de inhibidores de proteasaHalt Thermo Scientific78429
Immun-Blot membrana de PVDF 0,22µ mBIORAD1620177
cuentas Megamix-Plus FSCCOSMO BIO CO. LTD7802
NuPAGE LDS tampón de muestras 4XThermo ScientificNP0007
Optima ultracentrífuga con rotor 90Ti ángulo fijo 355530Beckamn CoulterXPN100
Page Azul solución de tinción de proteínasThermo Scientific24620
PE anti humano anticuerpo CD53BioLegend325406Añadir 5 µ L a la 20 µ L de uEVs en PBS Kit de
ensayo de proteínas Pierce BCAThermo Scientific23227
Tampón Pierce RIPAThermo Scientific89900
Tubos de centrífuga de pared gruesa de policarbonatoBeckamn Coulter355630
Spherotech Perlas de validación de 8 picos (FL1-FL3)BD Accuri653144
Spherotech Perlas de validación de 6 picos (FL4)BD Accuri653145
sacarosaSIGMA-Aldrich59378
TrietanolaminaSIGMA-Aldrich90279

Referencias

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