Preparación de cortes agudos de cerebro del polo dorsal del hipocampo de roedores adultos

Resumen

El propósito de este protocolo es describir un método para producir cortes del hipocampo dorsal para el examen electrofisiológico. Este procedimiento emplea la perfusión con ACSF refrigerado antes de la preparación del corte con un ángulo de corte cercano al coronal que permite la preservación de las neuronas principales sanas.

Resumen

Los registros de patch-clamp de células enteras de cortes agudos de cerebro de roedores son un pilar de la investigación neurofisiológica moderna, ya que permiten una medición precisa de las propiedades celulares y sinápticas. Sin embargo, existe una necesidad cada vez mayor de realizar análisis correlacionados entre diferentes modos experimentales además de la electrofisiología de cortes, por ejemplo: inmunohistoquímica, biología molecular, imágenes in vivo o registro electrofisiológico; para responder a preguntas cada vez más complejas sobre la función cerebral. Sin embargo, sacar conclusiones significativas a partir de estos diversos enfoques experimentales no es sencillo, ya que incluso dentro de estructuras cerebrales relativamente bien descritas, existe un alto grado de variación subregional de la función celular. En ninguna parte se ejemplifica esto mejor que en el CA1 del hipocampo, que tiene propiedades dorso-ventrales bien definidas, basadas en propiedades celulares y moleculares. Sin embargo, muchos estudios publicados examinan los patrones de expresión de proteínas o la actividad in vivo correlacionada conductualmente en la extensión dorsal del hipocampo; y explicar los hallazgos mecanicistas con la electrofisiología celular de la región ventromedial. Esto se confunde aún más por el hecho de que muchos experimentos electrofisiológicos de corte agudo se realizan en animales jóvenes, mientras que otros modos experimentales se realizan en animales más maduros. Para abordar estos problemas, este método incorpora la perfusión transcárdica de roedores maduros (>60 días de edad) con líquido cefalorraquídeo artificial, seguida de la preparación de cortes coronales modificados, incluido el polo septal del hipocampo dorsal, para registrar las células piramidales CA1. Este proceso conduce a la generación de cortes agudos sanos del hipocampo dorsal, lo que permite la interrogación electrofisiológica celular basada en cortes que coincide con otras medidas.

Introducción

El hipocampo es posiblemente la estructura mejor estudiada en el cerebro de los mamíferos, debido a su tamaño relativamente grande y su estructura laminar prominente. El hipocampo ha sido implicado en una serie de procesos conductuales: la navegación espacial, la memoria contextual y la formación de episodios. Esto se debe, en parte, a la relativa facilidad de acceso a las porciones dorsales del hipocampo en roedores para análisis in vivo . De hecho, las principales celdas de salida suelen estar a menos de 2 mm de la superficie del pial.

En los roedores, el hipocampo es una estructura relativamente....

Protocolo

Todos los animales fueron generados y mantenidos de acuerdo con las directrices del Ministerio del Interior e Institucionales (HO# P135148E). Todas las ratas se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se les dio acceso ad libitum a comida y agua.

1. Perfusión transcárdica de ACSF refrigerado

1. Antes de todos los experimentos, coloque ~200 mL de sacarosa-ACSF (Tabla 1) en el congelador a -20 °C (hasta que esté semicongelada, para cortar) y otros ~100-200 mL de sacarosa-ACSF filtrada en hielo (para perfusión), burbujeando con carbgeno (95% Ø₂/5% CO....

Resultados

El protocolo descrito anteriormente permite la preparación de cortes viables desde el polo septal del hipocampo dorsal en ratas maduras. Un factor clave en este protocolo es la perfusión de sacarosa refrigerada-ACSF, antes de la preparación del corte, lo que da como resultado CA1 PC sanos proximales a la superficie del corte. La calidad del corte producido se evalúa visualmente bajo la óptica IR-DIC, y las células sanas identificadas con cuerpos celulares grandes y de forma ovoide se encuentran en toda la extensión del <.......

Discusión

Aquí, se describe un protocolo para producir cortes de cerebro de alta calidad a partir de la extensión dorsal del CA1 del hipocampo, lo que permite grabaciones de múltiples neuronas viables dentro de esta región. El enfoque combinatorio del registro de células completas a partir de cortes cercanos a la corona seguido de la visualización de neuronas es fundamental para la confirmación de la viabilidad y la identidad de la célula.

Este protocolo produce de form.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Software de adquisición	Molecular Devices	pClamp 10
Ratas adultas	Varios	n/a	Cualquier cepa de rata adulta (60 días o más)
Amplificador	Molecular Devices	Axopatch 700B
Software de análisis	Freeware	Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit
Tijeras para huesos	FST	16152-12	Estilo Littauer
Vidrio capilar	Harvard Apparatus	30-0060	Pipetas de vidrio de borosilicato con filamento de 1,5 mm de diámetro exterior, 0,86 mm de diámetro interior.
Carbogen	BOC	Varios	95% O2/5% CO2
CCD cámara	Scientifica	SciCamPro	https://www.scientifica.uk.com/products/
Químicos/Reactivos	Sigma	Aldrich Varios	Todos los reactivos de laboratorio adquiridos de Sigma Aldrich.
Cianoacrilato (es decir, RS Pro 3)	Componentes RS	918-6872	Evite las formulaciones de cianoacrilato a base de gel
Digitalizador	Dispositivos moleculares	Digidata 1550B
Alfileres/agujas de disección	Varios	Varios	Uso Agujas de calibre 16 (arriba)
Sistema de electrofisiología	Scientifica	SliceScope	https://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
Tijeras de iris fino	FST	14568-12	Con puntas de carburo de tungsteno Placa de
Petri de vidrio	Fisher Scientific	12911408
Agujas hipodérmicas	BD Healthcare	Varios	calibre 16, 18 y 22
100% W/W (es decir, IsoFlo)	Zoetis	50019100
Tijeras tipo Mayo	FST	14110-17	Micromanipuladores de puntas romas
	Scientifica	Microstar	https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
Pincel	Tienda de arte	n/a	Un pincel de cerdas finas, adquirido en una tienda de arte local.
Pipeta Pasteur	Fisher Scientific 11546963		Una pipeta Pasteur de vidrio, pero cortada de manera que el extremo romo se utilice para transferir la pipeta.
Bomba peristáltica	Watson Marlow	12466260	Bomba peristáltica de un solo canal
Extractor de pipetas	Sutter Instruments	P-97	Otros modelos y métodos de producción de pipetas funcionarían igual de bien.
Jeringas de plástico (1, 2, 5 mL)	BD Healthcare	Varios
Herramienta ósea Rongeur	FST	16021-14
Cámara de retención de rebanadas	Hecho en
Peso de rebanadas/arpa	Aparato Harvard	SHD-22L/15	Las alternativas serían adecuadas.
Pentobarbital sódico (es decir, Pentoject)	Animalcare Ltd	10347/4014	200 mg/mL; otras formulaciones de pentobarbital serían adecuadas
Espátula	Bochem	3213	Disponible en Fisher Scientific
Filtros de jeringa	Scientific	10482012	Corning marca Filtros, 0,22 y micro; m diámetro de poro.
Vibtratome	Leica	1491200S001	modelo VT1200S con
baño de agua	Fisher Scientific	15167015	baño de agua de 5 litros, por ejemplo: Grant Instruments™ JBA5 scientifica-scicam-pro

Isofluorano de casa Fisher Vibrocheck