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Artículo de método

Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

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DOI:

10.3791/61704

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28 de agosto de 2020

1Department of Neuroscience, Mortimer B. Zuckerman Mind Brain Behavior Institute, Columbia University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la preparación de rodajas horizontales de corteza hipocampal-entorrinaal (HEC) de ratones que exhiben actividad espontánea de ondulación de onda aguda. Las rodajas se incuban en una cámara de retención de interfaz simplificada y las grabaciones se realizan en condiciones sumergidas con líquido cefalorraquídeo artificial de flujo rápido para promover la oxigenación tisular y la aparición espontánea de la actividad a nivel de red.

Resumen

El corte cerebral agudo de roedores ofrece un enfoque experimental tractable para obtener información sobre la organización y función de los circuitos neuronales con resolución unicelular mediante electrofisiología, microscopía y farmacología. Sin embargo, una consideración importante en el diseño de experimentos in vitro es hasta qué punto diferentes preparaciones de rebanadas recapitulan patrones naturalistas de actividad neuronal como se observa in vivo. En el cerebro intacto, la red de hipocampos genera una actividad poblacional altamente sincronizada que refleja el estado conductual del animal, como lo ejemplifican los complejos de ondulación de onda aguda (SWR) que se producen durante la vigilia de los estados consumados o el sueño no REM. Los SWR y otras formas de actividad de la red pueden surgir espontáneamente en rodajas de hipocampo aisladas en condiciones apropiadas. Con el fin de aplicar el potente kit de herramientas de corte cerebral a la investigación de la actividad de la red de hipocampo, es necesario utilizar un enfoque que optimice la salud de los tejidos y la preservación de la conectividad funcional dentro de la red del hipocampo. Los ratones se fusionan transcardialmente con líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa fría. Las rodajas horizontales que contienen el hipocampo se cortan a un espesor de 450 μm para preservar la conectividad sináptica. Los sectores se recuperan en una cámara de estilo interfaz y se transfieren a una cámara sumergida para grabaciones. La cámara de grabación está diseñada para la superfusión de doble superficie de líquido cefalorraquídeo artificial a un alto caudal para mejorar la oxigenación de la rebanada. Este protocolo produce tejido sano adecuado para la investigación de la actividad compleja y espontánea de la red in vitro.

Introducción

La medición electrofisiológica de las rodajas de hipocampo vivos in vitro es un potente enfoque experimental con numerosas ventajas. El experimentador puede utilizar un microscopio, micromanipuladores y un sistema de grabación para visualizar y recopilar directamente mediciones de neuronas individuales en el tejido. Las rodajas de tejido también son muy accesibles para la fototimulación o la administración de fármacos para experimentos optogenéticos, químicos o farmacológicos.

La red hipocampal genera una actividad poblacional altamente sincrónica in vivo,visible como oscilaciones en el potencial de campo local extracelular1,2,3,4,5. Los métodos de corte cerebral se han aprovechado para obtener información sobre los mecanismos celulares y de circuito subyacentes a estas oscilaciones de la red neuronal. El trabajo fundacional de Maier et al. demostró que los complejos afilados de onda-ondulación (SWR) pueden emerger espontáneamente en rodajas del hipocampo ventral6,7. Estudios posteriores de múltiples investigadores han aclarado gradualmente muchos aspectos de los SWR, incluyendo el papel de los neuromoduladores en la regulación del estado de red del hipocampo8,9,10 y los mecanismos sinápticos que impulsan la reactivación in vitro de conjuntos neuronales previamente activos durante el comportamiento in vivo11. Los experimentos de corte cerebral también han proporcionado información sobre la oscilación del rango gamma (30-100 Hz), un estado de red hipocampal distinto que se cree que admite la codificación de memoria y la recuperación12,13. Por último, reconociendo el papel central del hipocampo y las estructuras asociadas en la fisiopatología de la epilepsia del lóbulo temporal14,15,los investigadores han utilizado preparaciones de rebanadas de hipocampo para investigar la generación y propagación de la actividad epileptiforme. Carter y otros demostraron que las rodajas combinadas de corteza hipocampal-entorrinal preparadas a partir de animales crónicamente epilépticos pueden generar espontáneamente descargas epileptiformes in vitro16. Posteriormente, Karlócai et al. exploró los mecanismos subyacentes a las descargas epileptiformes en rodajas de hipocampo mediante el uso de líquido cefalorraquídeo artificial modificado (ACSF) con concentraciones de iones alteradas (mg2+ reducido o K+elevado) o medicamentos añadidos (4AP o gabazina)17.

Los investigadores han desarrollado numerosos enfoques de rebanadas de hipocampo que difieren de maneras clave: (1) la región del hipocampo contenida en la rebanada (dorsal, intermedia o ventral); 2) la presencia o ausencia de tejidos extrahippocampales como la corteza entorrina; (3) la orientación utilizada para cortar rodajas (coronales, sagitales, horizontales u oblicuas); y (4) las condiciones en las que se mantiene el tejido después del corte (sumergido completamente en ACSF o mantenido en la interfaz de ACSF y aire humidificado y rico en carbohidratos).

La elección de qué enfoque de corte debe determinarse mediante el objetivo experimental. Por ejemplo, las rodajas transversales o coronales del hipocampo dorsal mantenido en condiciones sumergidas se han utilizado muy eficazmente para la investigación de circuitos intrahippocampales y plasticidad sináptica18,19,20. Sin embargo, tales preparaciones no generan espontáneamente oscilaciones de red tan fácilmente como las rebanadas del hipocampo ventral21,22,23. Aunque un estado de actividad persistente de SWR puede ser inducido por estimulación tetánica en rodajas transversales del hipocampo dorsal y ventral24,los SWR espontáneos se observan más fácilmente en las rodajas ventrales7,25.

Una distinción fisiológica y anatómica inherente entre el hipocampo dorsal y ventral está respaldada por estudios realizados tanto in vivo como in vitro26. Las grabaciones en ratas revelaron ritmos theta fuertemente coherentes a lo largo del hipocampo dorsal e intermedio, pero mala coherencia entre la región ventral y el resto del hipocampo27. Los SWR in vivo se propagan fácilmente entre el hipocampo dorsal e intermedio, mientras que los SWR que se originan en el hipocampo ventral a menudo permanecen locales28. Las proyecciones asociacionales originadas a partir de neuronas piramidales CA3 que residen en el hipocampo dorsal e intermedio proyectan largas distancias a lo largo del eje longitudinal del hipocampo. Las proyecciones ca3 procedentes de regiones ventrales siguen siendo relativamente locales y, por lo tanto, tienen menos probabilidades de ser cortadas durante el proceso de corte29,30. Por lo tanto, las rodajas ventrales pueden conservar mejor la red recurrente necesaria para generar sincronia de población. La propensión de las rodajas ventrales a generar actividades espontáneas de red in vitro también puede reflejar una mayor excitabilidad intrínseco de las neuronas piramidales o una inhibición GABAérgica más débil en el hipocampo ventral en comparación con las regiones más dorsales31. De hecho, las rodajas de hipocampo ventral son más susceptibles a la actividad epileptiforme32,33. Así, muchos estudios de oscilaciones fisiológicas espontáneas de red8,9,11,24 o patológicas16,34,35,36 han utilizado tradicionalmente un enfoque de corte horizontal, a veces con un ligero ángulo en la dirección fronto-occipital, que produce rodajas de tejido paralelas al plano transversal del hipocampo ventral.

La conectividad de red se ve inevitablemente afectada por el procedimiento de corte, ya que muchas celdas del sector se cortarán. El ángulo y el grosor de la rebanada y el tejido retenido en la preparación deben considerarse para optimizar la conectividad en los circuitos de interés. Muchos estudios han utilizado rodajas horizontales combinadas de corteza hipocampal-entorrinales (HEC) para explorar interacciones entre las dos estructuras en el contexto de oscilaciones fisiológicas o patológicas de la red. Roth et al. realizaron grabaciones duales desde el subcampo CA1 del hipocampo y la capa V de la corteza entorrinal medial para demostrar la propagación de la actividad SWR a través de la rebanadaHEC 37. Muchos estudios de actividad epileptiforme han utilizado la preparación de la rebanada HEC para investigar cómo se propagan las descargas epileptiformes a través de la red corticohippocampal16,35,36,38. Es importante tener en cuenta que la preservación del bucle corticohippocampal intacto no es un requisito previo para los SWR espontáneos, descargas epileptiformes o oscilaciones gamma; las oscilaciones de red se pueden generar en rodajas transversales del hipocampo dorsal o ventral sin tejidos parahippocampales unidos21,22,23, 25,39,40,41. Un factor más importante para la generación espontánea de oscilaciones de red en rodajas de hipocampo puede ser el grosor de cada rebanada, ya que una rebanada más gruesa (400-550 μm) preservará más conectividad en la red recurrente CA2/CA321,22,25.

Aunque se han utilizado rodajas HEC horizontales en ángulo (cortadas con un ángulo aproximado de 12° en la dirección fronto-occipital) para estudiar la conectividad funcional del bucle corticohippocampal11,16,34,35,42,tales preparaciones en ángulo no son necesarias para la actividad espontánea de la red43,44,45. Sin embargo, el uso de un plano de corte en ángulo permite al investigador hacer selectivamente rodajas que conserven mejor las lamellas orientadas transversalmente del hipocampo ventral o intermedio, dependiendo de si se aplica un ángulo hacia abajo o hacia arriba(Figura 1). Este enfoque es conceptualmente similar al utilizado por Papatheodoropoulos et al., 2002, que diseccionó cada hipocampo libre y luego utilizó un helicóptero de tejido para crear rodajas transversales a lo largo de todo el eje dorsal-ventral21. A la luz de las distinciones funcionales antes mencionadas entre el hipocampo ventral y dorsal-intermedio, los investigadores deben considerar el origen anatómico de las rodajas al diseñar experimentos o interpretar resultados. El uso de una rampa de agar durante el procedimiento de corte es una manera sencilla de producir preferentemente rodajas del hipocampo intermedio o ventral.

Las rodajas de hipocampo se pueden mantener en una cámara sumergida (con el tejido completamente sumergido en ACSF), o una cámara de estilo interfaz (por ejemplo, cámara Oslo o Haas, con rodajas cubiertas sólo por una fina película de medios que fluyen). El mantenimiento de la interfaz mejora la oxigenación del tejido, que promueve la supervivencia neuronal y permite niveles altos sostenidos de actividad interneuronal. Tradicionalmente, las condiciones de registro sumergidas utilizan un caudal de ACSF más lento que no proporciona una oxigenación adecuada del tejido para una expresión estable de las oscilaciones a nivel de red. En las rodajas de hipocampo sumergido oscilaciones gamma inducidas por carbachol sólo se observan transitoriamente46,47, mientras que se pueden mantener establemente en las cámaras de grabación de interfaz10,48,49. Como tal, muchos estudios de actividad espontánea compleja in vitro se han basado en cámaras de registro de interfaz para investigar complejos de ondulación de ondulación aguda6,7,8,9,10,25,37,oscilaciones gamma10,13,y actividad epileptiforme16,38,45,47.

En una cámara de grabación de estilo sumergido, se puede utilizar un objetivo de microscopio de inmersión para visualizar células individuales y dirigirse selectivamente a células de aspecto saludable para grabaciones. La preparación sumergida también permite un control fino sobre el entorno celular, ya que la inmersión facilita la rápida difusión de fármacos u otros compuestos al tejido. Por lo tanto, una metodología modificada en la que se mantienen oscilaciones estables de la red en condiciones sumergidas representa un enfoque experimental potente. Este enfoque se ejemplifica con el trabajo de Hájos et al., en el que las rodajas de hipocampo se recuperan en una cámara de sujeción simplificada de estilo interfaz durante varias horas antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida modificada con un alto caudal de ACSF (~6 mL/min) para mejorar el suministro de oxígeno al tejido12,48,49. En estas condiciones, se pueden mantener altos niveles de actividad interneuron y oscilaciones espontáneas estables de la red en una cámara de grabación sumergida. Este enfoque modificado permite a los investigadores realizar grabaciones de abrazaderas de parches de células enteras guiadas visualmente y caracterizar la contribución de los tipos celulares identificados morfológicamente a las oscilaciones gamma inducidas por carbachol12. Los SWR también pueden ocurrir espontáneamente en rodajas de hipocampo sumergidas con un caudal rápido de ACSF11,48,49. Maier et al. demostraron que las rodajas de hipocampo que se recuperaban en una cámara de interfaz antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida mostraban de forma fiable swrs espontáneos, mientras que las rodajas que se recuperaban sumergidas en un vaso de precipitados antes de ser transferidas a una cámara de grabación sumergida mostraban respuestas de campo evocadas más pequeñas, niveles más bajos de corrientes sinápticas espontáneas, y sólo muy rara vez mostraban SWR espontáneos43. Schlingloff et al. utilizaron esta metodología mejorada para demostrar el papel de las células de cesta que expresan parvalbumina en la generación de SWRespontáneos 44.

El siguiente protocolo presenta un método de corte a través del cual las neuronas espontáneamente activas en rodajas de hipocampo horizontal pueden recuperarse en condiciones de interfaz y posteriormente mantenerse en una cámara de grabación sumergida adecuada para manipulaciones farmacológicas u optogenéticas y grabaciones guiadas visualmente.

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Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia (AC-AAAU9451).

1. Preparar soluciones

  1. Preparar solución de corte de sacarosa para cortar como se describe en la Tabla 1.
    NOTA: Después de preparar 1 L de solución de sacarosa, congele una pequeña cantidad (aproximadamente 100-200 ml) en una bandeja de hielo. Estos cubitos de hielo de sacarosa congelados se mezclarán en un purines helados (ver paso 4.3).
  2. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) para su registro como se describe en la Tabla 2.
  3. Preparar 1 M de NaCl para pipetas de estimulación mediante la disolución de 0,05844 g de NaCl en 1 ml de agua purificada que se ha filtrado para eliminar los metales traza y otras impurezas.
    NOTA: La solución de corte de sacarosa y el ACSF deben prepararse frescos para cada experimento.

2. Preparar la rampa del agar

  1. Preparar 4% de agar (por ejemplo, 2 g de agar en 50 ml de agua) disolviendo polvo de agar en agua purificada que se ha filtrado para eliminar los metales traza y otras impurezas. Caliente la mezcla en un microondas hasta que empiece a hervir (aproximadamente 30-60 s). Vierta el agar fundido en un molde y deje que se enfríe y solidifique a 4 °C en una nevera a una inclinación de aproximadamente 12°.
    NOTA: Para un molde, se puede utilizar cualquier recipiente de vidrio o plástico en un ángulo, con suficiente agar fundido vertido para formar una rampa de 4 cm de longitud y aproximadamente 0,8 cm de altura.

3. Escenificar el área de corte

  1. Llene un vaso de precipitados de 400 ml que contenga una cámara de recuperación de rebanadas con aproximadamente 250 ml de ACSF; colocarlo en un baño de agua calentado a 32 °C y comenzar a burbujear con carbógeno (95% gas oxígeno / 5% gas de dióxido de carbono).
    NOTA: Llene el vaso de precipitados de recuperación con suficiente líquido para colocar la malla de nylon de la cámara de sujeción en la misma superficie de la solución, de modo que las rodajas se mantendrán en la interfaz de la mezcla de solución caliente y el aire(Figura 1). Coloque pequeños trozos de papel de lente en la malla de nylon. Las rodajas se colocarán encima del papel de la lente, que más tarde se puede utilizar para transferir rebanadas individualmente a la cámara de grabación (ver paso 6.6).
  2. Coloque un matraz con la solución de sacarosa en un cubo de hielo para enfriar y comenzar a burbujear con carbógeno.
    NOTA: El vaso de recuperación y la solución de sacarosa deben calentarse y enfriarse, respectivamente, con burbujeo de carbógenos durante al menos 30 minutos antes de colocar el ratón en la cámara isoflurano.
  3. Extraiga la bandeja de cubitos de hielo de solución de sacarosa prefabricados y congelados del congelador y colóquelo en el banco para descongelarlo parcialmente.
  4. Coloque la mitad de una cuchilla de afeitar limpia de doble filo en el microtome y calibrar si es necesario. Reserve la otra mitad de la cuchilla de afeitar para su uso durante la disección.
  5. Ejecute una línea de carbógenos y una sonda de temperatura en la cámara de corte y envuel sea rodeada de hielo para enfriar la cámara.
  6. Prepare un banco o mesa limpio cubierto con dos almohadillas absorbentes desechables. Poner todas las herramientas de disección y tres piezas de cinta de laboratorio en la almohadilla izquierda, donde se realizará la perfusión transcardial.
    NOTA: Las herramientas de disección incluyen pequeñas tijeras Bonn, tijeras disecctores, espátula/cuchara grandes, microspago, bisturí con nueva hoja, espátula, tijeras quirúrgicas afiladas/contundentes, fórceps de tejido grandes y fórceps de tejido pequeño (ver Tabla de Materiales).
  7. En la otra almohadilla absorbente a la derecha del área de perfusión, coloque un trozo circular de papel filtrante en la tapa de una placa Petri de vidrio de 100 mm de diámetro. Coloque la parte inferior de la placa de Petri junto a la tapa y coloque una línea de carbógeno en ambos trozos del plato.
  8. Utilice una cuchilla de afeitar o bisturí para cortar una pequeña rampa de agar (aproximadamente 4 cm a lo largo de la superficie en ángulo, 0,8 cm de altura, 2 cm de ancho). Corte un pedazo de la rampa del extremo alto y revierta para crear un bloque de respaldo de agar. Utilice el adhesivo de cianoacrilato para colocar la rampa del agar y el bloque de respaldo en la plataforma de corte y reservar.
    NOTA: El bloque de respaldo del agar ayuda a estabilizar el cerebro durante el corte y proporciona una superficie en la que diseccionar tejidos innecesarios de cada rebanada (Figura 1).

4. Perfusión transcardial

  1. Suspenda una jeringa de 60 ml de capacidad como depósito para la solución de corte de sacarosa aproximadamente 18 pulgadas por encima de la sobremesa (por ejemplo, utilizando una abrazadera giratoria de tres puntas en un poste vertical). Conecte el tubo a la parte inferior del depósito, ejecute el tubo a través de una abrazadera de rodillos y conecte el otro extremo del tubo a una aguja limpia de 20 G.
  2. Llene el depósito de 60 ml con aproximadamente 30 ml de solución de sacarosa refrigerada y dirija una línea de carbógenos al depósito de sacarosa para burbujear continuamente el perfusato.
    NOTA: Asegúrese de que la sacarosa fluya a través del tubo y la aguja sin burbujas atrapadas. El caudal debe ser lo suficientemente rápido como para tener un flujo constante y continuo de sacarosa goteando de la aguja.
  3. Usando una licuadora, tritura y mezcla la sacarosa congelada en un purines helados y usa la espátula/cuchara grande para distribuir los purines.
    1. Coloque una pequeña cantidad de purines de sacarosa alrededor de los bordes de la tapa de la placa de Petri de vidrio. Añade una pequeña cantidad de purines de sacarosa a la parte inferior de la placa De Petri.
    2. Añadir aproximadamente 20-30 ml de purines de sacarosa al depósito de líquido de perfusión, mezclándolo bien con los 30 ml de sacarosa líquida refrigerada hasta que el depósito contenga una mezcla de sacarosa muy fría, predominantemente líquida, con alguna solución congelada remanente.
  4. Coloque el ratón en una cámara conectada a un vaporizador isoflurano. Con el oxígeno fluyendo a aproximadamente 2 L/min, gire la esfera del vaporizador para entregar isofluranos a una concentración del 5% y comience un temporizador.
    NOTA: Mantenga este temporizador en marcha durante todo el curso del corte para medir la rapidez con la que se obtienen las rebanadas. El procedimiento debe realizarse lo antes posible, de forma que el corte esté completo, y el tejido se esté recuperando en la cámara de interfaz en un plazo de 15-20 minutos a partir de que el animal entre en la cámara isoflurano. Observe el ratón para asegurarse de que se logra un estado de anestesia profunda. Después de un mínimo de 5 minutos, el ratón debe ser profundamente anestesiado y no responde a pellizcos de los dedos del pie.
  5. Inmediatamente antes de retirar el ratón de la cámara isoflurano, llene la tapa de la placa De Petri con solución de sacarosa refrigerada a una profundidad de aproximadamente 3-5 mm y llene el fondo de la placa Petri con solución de sacarosa fría a una profundidad de aproximadamente 1,0 cm.
  6. Transfiera rápidamente el ratón a la almohadilla absorbente izquierda y utilice las 3 piezas de cinta para asegurar las extremidades delanteras y la cola. Realice un pellizco del dedo del pie trasero para asegurarse de que el ratón no responde antes de realizar cualquier incisión. Usando las fórceps de tejido grandes y tijeras quirúrgicas, carpa la piel y hacer una incisión a lo largo desde la parte inferior del esternón hasta la parte superior del pecho. Usando las fórceps tire hacia arriba en el esternón y use las tijeras para cortar a través del diafragma.
    NOTA: El posicionamiento inicial del ratón y las primeras incisiones para cortar el diafragma deben realizarse lo más rápido posible para garantizar que el ratón no recupere la conciencia. Para garantizar una profundidad adecuada de anestesia durante todo el procedimiento, se puede colocar un cono nasal en el ratón para suministrar isofluranos durante la perfusión.
  7. Utilice las tijeras para cortar a través de la caja torácica a cada lado, cortando en un gran movimiento hacia el punto donde la extremidad delantera se encuentra con el cuerpo. Con las fórceps, balancee la parte delantera de la caja torácica hacia la cabeza, y luego retírela completamente con un corte horizontal usando las tijeras grandes. Sujete el corazón en su lugar usando las fórceps grandes e inserte la aguja de perfusión de 20 G en el ventrículo izquierdo. Una vez que la aguja se coloca correctamente, el lado izquierdo del corazón debe palidecer rápidamente a medida que la solución de sacarosa fría llena el ventrículo.
  8. Utilice las pequeñas tijeras dissector para cortar en el atrio derecho y permitir que la sangre fluya fuera del sistema circulatorio. Si las incisiones se realizan correctamente, debe haber un daño mínimo en el corazón, y debe continuar bombeando a lo largo de la perfusión.
    NOTA: Los trozos enrollados de papel tisú se pueden utilizar para eliminar la solución de sangre y sacarosa del corazón y mantener la visibilidad de la aguja de perfusión durante el procedimiento.
  9. Asegúrese de que la aguja de perfusión permanezca en su lugar y no caiga del ventrículo izquierdo. Con un caudal y una colocación adecuados, el hígado comenzará a palidecer a un color bronceado/beige claro con 20-30 s.
  10. Después de 30-45 s, usa las tijeras grandes para decapitar al ratón. Sosteniendo la cabeza en la mano izquierda, empuje o pele la piel lejos del cráneo. En un animal bien perfundido, el cráneo debe ser muy pálido, y el cerebro debe aparecer de un color rosa muy claro (acercándose al blanco) a través del cráneo sin vasos sanguíneos claramente visibles.

5. Extraiga el cerebro y corte las rebanadas

  1. Usando las pequeñas tijeras bonn, hacer dos cortes laterales a través del cráneo hacia la línea media en la parte delantera del cráneo, cerca de los ojos. Haga dos cortes adicionales a ambos lados de la base del cráneo.
  2. Transfiera la cabeza a la parte inferior de la placa de cristal Petri, donde debe sumergirse principalmente en solución de sacarosa fría. Usa las pequeñas tijeras bonn para cortar la línea media a lo largo de la longitud del cráneo, tirando hacia arriba con las tijeras para minimizar el daño al tejido cerebral subyacente. Usando los pequeños fórceps tisulares, agarra firmemente cada lado del cráneo y colóquelo hacia arriba y lejos del cerebro, como abrir un libro.
  3. Utilice los dedos de la mano izquierda para mantener abiertas las aletas del cráneo e inserte la microspaácula debajo del cerebro cerca de las bombillas olfativas. Voltea el cerebro del cráneo hacia la sacarosa y usa la microspaátula para cortar el tallo cerebral. Lave el cerebro para eliminar cualquier sangre residual, pelaje u otros tejidos.
  4. Utilice la espátula/cuchara grande para transferir el cerebro a la tapa de la placa de cristal Petri. Con la otra mitad de la hoja de afeitar de doble filo previamente reservada, hacer dos cortes coronales para primero eliminar el cerebelo y luego la parte más anterior del cerebro, incluyendo las bombillas olfativas(Figura 1).
  5. Aplique adhesivo de cianoacrilato en la rampa del agar. Coloque muy brevemente el cerebro en un pedazo de papel filtrante seco usando los fórceps de tejido grandes y luego transfiéralo inmediatamente a la rampa del agar, colocando la superficie ventral del cerebro en el adhesivo.
    NOTA: Para las rodajas del hipocampo intermedio, el cerebro debe estar orientado con el anterior mirando hacia arriba de la pendiente de la rampa, y el posterior más cerca de la hoja. Para las rodajas del hipocampo ventral, oriente el cerebro con el extremo anterior apuntando hacia abajo por la pendiente de la rampa, con el extremo posterior en la parte superior de la rampa, más lejos de la hoja. En cualquier caso, el cerebro debe colocarse en la parte superior de la rampa, de tal manera que la superficie cortada coronalmente del cerebro entre en contacto con el bloque de respaldo del agar (Figura 1).
  6. Coloque la plataforma de corte con el agar y el cerebro en la cámara de corte del microtome y sumérjase completamente con solución de sacarosa refrigerada. Utilice la espátula/cuchara grande para transferir algunos purines de sacarosa a la cámara, revolviendo para derretir cualquier sacarosa congelada y reducir rápidamente la temperatura de la mezcla a ~1–2 °C.
    NOTA: Observe el indicador de temperatura durante todo el corte. Si la solución de sacarosa se calienta por encima de 3 °C, agregue más purines y mezcle para volver a bajar la temperatura.
  7. Corte las rodajas a un espesor de 450 μm con la velocidad del microtome establecida en 0,07 mm/s. A medida que se libera cada rebanada, utilice los pequeños fórceps tisulares y un bisturí afilado para separar primero los dos hemisferios, y luego para cortar el tejido hasta que la rebanada consista principalmente en las regiones del hipocampo y parahippocampal (Figura 1).
  8. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para transferir las rodajas individualmente a la cámara de recuperación de la interfaz, asegurándose de que se colocan en la interfaz del ACSF y el aire con sólo un menisco delgado de ACSF que cubre las rodajas. Cierre firmemente la tapa de la cámara y deje que las rodajas se recuperen a 32 °C durante 30 min.
  9. Después de la recuperación inicial a 32 °C, saque la cámara de recuperación de la interfaz del baño de agua y colóquela en un agitador ajustado a una velocidad lenta de modo que la barra de agitación magnética promueva la circulación de ACSF dentro de la cámara. Deje que se enfríe gradualmente a temperatura ambiente a medida que las rodajas se recuperan durante 90 minutos adicionales. Asegúrese de que la cámara de recuperación se burbujee continuamente con carbógeno y no permita que las burbujas grandes queden atrapadas debajo de las rodajas.

6. Realizar grabaciones de potencial de campo local (LFP) de actividad espontánea

  1. Prepárese para las grabaciones LFP encendiendo todo el equipo necesario, incluyendo el ordenador que ejecuta el software de adquisición, el monitor conectado al ordenador, los estimuladores, el micromanipulador, el controlador de temperatura, la fuente de luz del microscopio, la cámara conectada al microscopio, el amplificador de microelectrodos, el digitalizador y la bomba peristáltica. Si utiliza un sistema de vacío central, abra la válvula de pared para preparar la línea de vacío que extraerá ACSF de la cámara de grabación.
  2. Llene el depósito calentado con ACSF, luego coloque un extremo del tubo en el vaso de precipitados de 400 ml que contiene el ACSF burbujeante. Encienda la bomba peristáltica para dirigir acsf desde el vaso de precipitados de 400 ml hasta el depósito calentado, y desde el depósito hacia adelante a la cámara de grabación. Toque o pellizque el tubo para liberar cualquier burbuja atrapada.
  3. Ajuste la bomba peristáltica para asegurarse de que el caudal acsf a través de la cámara de grabación es rápido (~ 8-10 mL/min). Utilice una sonda de temperatura para asegurarse de que el ACSF está a 32 °C en el centro de la cámara de grabación.
    NOTA: Si acsf se entrega a la cámara de grabación utilizando una bomba peristáltica, un alto caudal puede resultar en una fluctuación significativa en el caudal. Los caudales constantes se pueden lograr utilizando un amortiguador de pulsación simple que consiste en una serie de jeringas vacías integradas en el tubo (Figura 2).
  4. Prepare la estimulación y el registro de pipetas de capilares de vidrio borosilicato utilizando un extractor de filamento calentado. El protocolo de extracción debe configurarse para producir pipetas con una resistencia de 2-3 MOhm para la estimulación o electrodos de grabación de potencial de campo local.
  5. Llene las pipetas de estimulación con pipetas NaCl y LFP de 1 M con ACSF.
  6. Sujete brevemente el tubo y apague la bomba para pausar el flujo de ACSF. Transfiera una rebanada a la cámara de grabación usando fórceps finos para agarrar una esquina del papel de la lente que la rebanada está descansando en la rebanada se pegará al papel de la lente. Coloque el papel de la lente y corte en la cámara de grabación con la rebanada hacia abajo, luego "pele" el papel de la lente dejando la rebanada sumergida en la cámara de grabación. Asegure el corte usando un arpa.
    NOTA: Las arpas se pueden comprar prefamente o hacer en el laboratorio utilizando una pieza en forma de U de acero inoxidable o platino y filamento de nylon fino.
  7. Coloque una pipeta de estimulación rellena de NaCl en el micromanipulador manual y avance lentamente la punta de la pipeta en la superficie de la rebanada (por ejemplo, en la capa de estrato radiatum) en un ángulo de aproximadamente 30-45°. Una vez que la punta de la pipeta entre en el tejido, avance la pipeta hacia adelante lentamente y abstenerse de grandes movimientos en la dirección lateral o vertical que podrían dañar innecesariamente los axones dentro de la rebanada. Coloque la punta de la pipeta al menos 50-100 μm de profundidad en la rebanada para evitar células cercanas a la superficie que se dañaron durante el corte.
  8. Coloque una pipeta LFP llena de ACSF en el soporte de pipeta conectado al micromanipulador motorizado. Aplique una presión positiva muy ligera utilizando la presión de la boca o una jeringa de 1 ml conectada a través de una válvula stopcock y una corta longitud de tubo al soporte de la pipeta.
    NOTA: Coloque las pipetas LFP dentro de la rebanada para registrar las señales de interés: en el caso de ondas de onda aguda, se debe colocar una pipeta LFP en el estrato piramidal (SP) y una segunda pipeta en el estrato radiatum (SR). Esta configuración permite grabaciones simultáneas de la onda afilada negativa en el SR y la oscilación de ondulación de alta frecuencia en el SP (Figura 3).
  9. El uso del micromanipulador avanza lentamente la punta de la pipeta LFP hacia la región de interés (por ejemplo, la capa de células piramidales CA1) en un ángulo de aproximadamente 30-45°. Coloque la punta de la pipeta al menos 50-100 μm de profundidad en la rebanada para evitar células cercanas a la superficie que se dañaron durante el corte. Mientras avanza la pipeta LFP, entregue continuamente un pequeño pulso de prueba de voltaje utilizando el software de adquisición y esté atento a un aumento repentino de la resistencia a los electrodos. Esto puede indicar que la pipeta ha sido obstruida o presionada contra una célula.
  10. Una vez que la pipeta LFP se coloca en la región de interés, libere cuidadosamente la presión positiva abriendo la válvula en el tubo conectado al soporte de pipeta.
  11. Para grabar la LFP en una segunda ubicación simultáneamente, repita los pasos 6.8–6.10 con una segunda pipeta y micromanipulador.
  12. Utilice el amplificador de microelectrodo en la configuración de abrazadera actual para registrar la actividad espontánea en el potencial de campo local después de utilizar la función de equilibrio de puente en el software de adquisición para corregir la resistencia en serie de la pipeta. Los SWR espontáneos aparecerán como desviaciones positivas en el potencial extracelular de la capa SP (Figura 3).
  13. Con el fin de registrar potenciales de campo evocados, utilice los estimuladores conectados al digitalizador para entregar un pulso de voltaje cuadrado corto (200 nosotros) a través de la pipeta de estimulación llena de NaCl. Ajuste el dial de voltaje de estimulación para evocar una gama de amplitudes de respuesta.

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Resultados

Aquí se presentan grabaciones representativas de sectores HEC preparados como se describe en este protocolo. Después de la recuperación en una cámara de retención de interfaz (Figura 1C), los sectores se transfieren individualmente a una cámara de grabación sumergida (Figura 2B). La cámara de grabación se suministra con ACSF saturado de carbógeno utilizando una bomba peristáltica(Figura 2A). La bomba primero extrae ACSF de un vaso d...

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Discusión

Hay varios pasos en este protocolo de corte diseñado para promover la salud de los tejidos y favorecer la aparición de la actividad espontánea de la red naturalista: el ratón se perfunde transcardialmente con solución de corte de sacarosa refrigerada; las rodajas de corteza horizontal-entorrinaal (HEC) se cortan a un espesor de 450 μm del hipocampo intermedio o ventral; las rodajas se recuperan en la interfaz de acsf calentado y aire humidificado, rico en carbohidratos; durante las grabaciones, las rodajas se sobrefunden...

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Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

El autor quiere agradecer a Steve Siegelbaum por su apoyo. La financiación es proporcionada por 5R01NS106983-02, así como 1 F31 NS113466-01.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Impresora 3DLulzbotLulzBot TAZ 6
Soporte de incubación de cortes de cerebro agudosNIH 3D Print Exchange3DPX-001623Diseñado por ChiaMing Lee, disponible en https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosina 5′-trifosfato sal de magnesioSigma AldrichA9187-500MG
Ag-Cl pellets molidosWarner64-1309, (E205)
agarBecton, Dickinson214530-500g
ácido ascórbicoAlfa Aesar36237
vaso de precipitados (250 mL)Kimax14000-250
vaso de precipitados (400 mL)Kimax14000-400
biocytinSigma AldrichB4261
batidoraOsterBRLY07-B00-NP0
Tijeras Bonn,becton pequeño, capilares de vidrio de14184-09
con filamento (Diámetro exterior 1,5 mm, diámetro interno 0,86 mm, longitud 10 cm)preferibles los capilares pulidos al fuegoSutter InstrumentsBF150-86-10HP
solución de cloruro de calcio (1 M)Cámara G-BiosciencesR040
OlympusOLY-150
gas carbógeno comprimido (95% oxígeno / 5% dióxido de carbono)AirgasX02OX95C2003102
oxígeno comprimidoAirgasOX 200
estimulador aislado de voltaje constanteDigitimer Ltd.Cubreobjetos DS2A-Mk.II
(22x50 mm)VWR16004-314
adhesivo de cianoacrilatoKrazy GlueKG925Lo ideal es utilizar la forma con pincel para la adquisición de datos de precisión
softwareAxograph N/ACualquier software equivalente (por ejemplo, pClamp) funcionaría.
Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop DellN/Anúmero de catálogo dependerá de la computadora específica: cualquier computadora funcionará siempre que pueda ejecutar software de adquisición de electrofisiología.
Digidata 1440AMolecular Devices1-2950-0367
temporizador digitalVWR62344-6414 canales Temporizador trazable
almohadillas absorbentes desechablesVWR56616-018
tijeras de disectorFine Science Tools14082-09
cuchillas de afeitar de doble filoPersonnaBP9020
dual automatic controlador de temperaturaWarner Instrument CorporationTC-344B
cámara de grabación optimizada de doble superficie o flujo laminarN/AN/ALa cámara presentada en este protocolo está hecha a medida. Un equivalente comercial sería el RC-27L de Warner Instruments.
bastidor para equiposAutomate ScientificFR-EQ70"Un bastidor no es estrictamente necesario, pero es útil para organizar la electrofisiología
Etilenglicol-bis(2-aminoetiéter)- N,N,N',N'-ácido teetraacético (EGTA)Sigma Aldrich324626-25GM
papel de filtroWhatman1004 070
escala finaMettler ToledoXS204DR
Tirador de micropipetas Flaming/MarrónSutter InstrumentsP-97
placa de Petri de vidrio (100 x 15 mm)Corning3160-101
glucosaFisher ScientificD16-1
Guanosina 5′-trifosfato sodio sal hidratoSigma AldrichG8877-250MG
cubos de hieloSigma AldrichBAM168072002-1EA
vaporizador de isofluranoServicios anestésicos generalesTec 3
Fisher Scientific15-901-10R
papel para lentesFisher Scientific11-996
fuente de luzOlympusTH4-100
solución de cloruro de magnesio (1 M)Calidad Biológico351-033-721EA
magnético barras de agitaciónFisher Scientific14-513-56El número de catálogo dependerá del tamaño de la barra de agitación.
micromanipuladorLuigs & Micromanipulador NeumannSM-5
(manual)MicroscopioScientifica LBM-2000-00
Microespátula
Dell2007FPb
La MultiClamp 700B debe incluir cabeceras, soportes para pipetas y un modelo de celda.
N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(ácido 2-etanosulfónico), (HEPES)Sigma AldrichH3375-25G
aguja (calibre 20, 1,5 pulgadas de longitud)Becton, Dickinson305176
filamento de nylonYLI Wonder Invisible Thread212-15-004tamaño 0,004. Este gato. # es de Amazon.com
malla de nylonWarner Instruments Corporation64-0198
bomba perstálticaHarvard Apparatus70-2027
Sal de fosfocreatina di(tris)Sigma AldrichP1937-1G
Soportes para pipetasMolecular Devices1-HL-U
platinoWorld PrecisionPT0203
filamento de ácido poliláctico (PLA)UltimakerRAL 9010
cloruro de potasioSigma AldrichP3911-500G
gluconato de potasioSigma Aldrich1550001-200MG
hidróxido de potasioSigma Aldrich60377-1KG
hojas de afeitar VWR55411-050
pinza de rodilloWorld Precision Instrumentsescala 14041
Mettler ToledoPM2000
mango de bisturíFine Science Tools10004-13
arpa de rodajasWarnerSHD-26GH/2
bicarbonato de sodioFisher ChemicalS233-500
cloruro de sodioSigma AldrichS9888-1KG
fosfato de sodio monobásico anhidroFisher ChemicalS369-500
piruvato de sodioFisher ChemicalBP356-100
espátulaVWR82027-520
espátula/cuchara, grandeVWR470149-442
hojas de bisturí estérilesFeather72044-10
agitador / placa calefactoraCorning6795-220
válvulas llave de paso, 1 víaWorld Precision Instruments14054
válvulas llave de paso, 3 víasWorld Precision Instruments14036
sacarosaAcros OrganicsAC177142500
soporte para abrazaderas giratorias Tijeras quirúrgicasFisher Scientific14-679Q
, afiladas/desafiladasFine Science ToolsJeringa 14001-12
(1 mL)309659Becton, Dickinson
(60 mL con punta Luer-Lok)Becton, Dickinson309653
pinza de tres puntasPinza de tejido Fisher Scientific05-769-8Q
, grandeFine Science Tools11021-15
pinza de tejido, pequeñaFine Science Tools11023-10
pipetas de transferenciaFisher Scientific13-711-7M
tuboTygonE-3603ID 1/16 pulgada, OD 3/16 pulgada
tubo TygonR-3603ID 1/8 pulgada, OD 1/4 pulgada
grasa de vacíoDow Corning14-635-5D
micrótomo de cuchilla vibratoriaLeicaVT 1200S
mesa de amortiguación de vibraciones con jaula de FaradayMicro-G / TMC-ametek2536-516-4-30PE
matraz aforado (1 L)KimaxKIM-28014-1000
matraz aforado (2 L)PYREX65640-2000
baño de agua calienteVWR1209
 
borosilicato Dickinson Son de . El Cinta de laboratorio Olympus BX51WI Monitor Fine Science Tools 10089-11 MultiClamp 700B Amplificador de microelectrodos Molecular Devices MULTICLAMP 700B alambre de Jeringa de Pinza de tres puntas

Referencias

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