Este protocolo describe la preparación de rodajas horizontales de corteza hipocampal-entorrinaal (HEC) de ratones que exhiben actividad espontánea de ondulación de onda aguda. Las rodajas se incuban en una cámara de retención de interfaz simplificada y las grabaciones se realizan en condiciones sumergidas con líquido cefalorraquídeo artificial de flujo rápido para promover la oxigenación tisular y la aparición espontánea de la actividad a nivel de red.
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Artículo de método
Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo
En este artículo
Resumen
Resumen
El corte cerebral agudo de roedores ofrece un enfoque experimental tractable para obtener información sobre la organización y función de los circuitos neuronales con resolución unicelular mediante electrofisiología, microscopía y farmacología. Sin embargo, una consideración importante en el diseño de experimentos in vitro es hasta qué punto diferentes preparaciones de rebanadas recapitulan patrones naturalistas de actividad neuronal como se observa in vivo. En el cerebro intacto, la red de hipocampos genera una actividad poblacional altamente sincronizada que refleja el estado conductual del animal, como lo ejemplifican los complejos de ondulación de onda aguda (SWR) que se producen durante la vigilia de los estados consumados o el sueño no REM. Los SWR y otras formas de actividad de la red pueden surgir espontáneamente en rodajas de hipocampo aisladas en condiciones apropiadas. Con el fin de aplicar el potente kit de herramientas de corte cerebral a la investigación de la actividad de la red de hipocampo, es necesario utilizar un enfoque que optimice la salud de los tejidos y la preservación de la conectividad funcional dentro de la red del hipocampo. Los ratones se fusionan transcardialmente con líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa fría. Las rodajas horizontales que contienen el hipocampo se cortan a un espesor de 450 μm para preservar la conectividad sináptica. Los sectores se recuperan en una cámara de estilo interfaz y se transfieren a una cámara sumergida para grabaciones. La cámara de grabación está diseñada para la superfusión de doble superficie de líquido cefalorraquídeo artificial a un alto caudal para mejorar la oxigenación de la rebanada. Este protocolo produce tejido sano adecuado para la investigación de la actividad compleja y espontánea de la red in vitro.
Introducción
La medición electrofisiológica de las rodajas de hipocampo vivos in vitro es un potente enfoque experimental con numerosas ventajas. El experimentador puede utilizar un microscopio, micromanipuladores y un sistema de grabación para visualizar y recopilar directamente mediciones de neuronas individuales en el tejido. Las rodajas de tejido también son muy accesibles para la fototimulación o la administración de fármacos para experimentos optogenéticos, químicos o farmacológicos.
La red hipocampal genera una actividad poblacional altamente sincrónica in vivo,visible como oscilaciones en el potencial de campo local extracelula....
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia (AC-AAAU9451).
1. Preparar soluciones
- Preparar solución de corte de sacarosa para cortar como se describe en la Tabla 1.
NOTA: Después de preparar 1 L de solución de sacarosa, congele una pequeña cantidad (aproximadamente 100-200 ml) en una bandeja de hielo. Estos cubitos de hielo de sacarosa congelados se mezclarán en un purines helados (ver paso 4.3). - Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) para su registro como se describe en ....
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Resultados
Aquí se presentan grabaciones representativas de sectores HEC preparados como se describe en este protocolo. Después de la recuperación en una cámara de retención de interfaz (Figura 1C), los sectores se transfieren individualmente a una cámara de grabación sumergida (Figura 2B). La cámara de grabación se suministra con ACSF saturado de carbógeno utilizando una bomba peristáltica(Figura 2A). La bomba primero extrae ACSF de un vaso d.......
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Discusión
Hay varios pasos en este protocolo de corte diseñado para promover la salud de los tejidos y favorecer la aparición de la actividad espontánea de la red naturalista: el ratón se perfunde transcardialmente con solución de corte de sacarosa refrigerada; las rodajas de corteza horizontal-entorrinaal (HEC) se cortan a un espesor de 450 μm del hipocampo intermedio o ventral; las rodajas se recuperan en la interfaz de acsf calentado y aire humidificado, rico en carbohidratos; durante las grabaciones, las rodajas se sobrefunden.......
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
El autor quiere agradecer a Steve Siegelbaum por su apoyo. La financiación es proporcionada por 5R01NS106983-02, así como 1 F31 NS113466-01.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Impresora 3D | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Soporte de incubación de cortes de cerebro agudos | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Diseñado por ChiaMing Lee, disponible en https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosina 5′-trifosfato sal de magnesio | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl pellets molidos | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ácido ascórbico | Alfa Aesar | 36237 | |
| vaso de precipitados (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| vaso de precipitados (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| batidora | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Tijeras Bonn, | becton pequeño, capilares de vidrio de | 14184-09 | |
| con filamento (Diámetro exterior 1,5 mm, diámetro interno 0,86 mm, longitud 10 cm) | preferibles los capilares pulidos al fuego | Sutter Instruments | BF150-86-10HP |
| solución de cloruro de calcio (1 M) | Cámara G-Biosciences | R040 | |
| Olympus | OLY-150 | ||
| gas carbógeno comprimido (95% oxígeno / 5% dióxido de carbono) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| oxígeno comprimido | Airgas | OX 200 | |
| estimulador aislado de voltaje constante | Digitimer Ltd. | Cubreobjetos DS2A-Mk.II | |
| (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| adhesivo de cianoacrilato | Krazy Glue | KG925 | Lo ideal es utilizar la forma con pincel para la adquisición de datos de precisión |
| software | Axograph N | /A | Cualquier software equivalente (por ejemplo, pClamp) funcionaría. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop Dell | N/A | número de catálogo dependerá de la computadora específica: cualquier computadora funcionará siempre que pueda ejecutar software de adquisición de electrofisiología. | |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| temporizador digital | VWR | 62344-641 | 4 canales Temporizador trazable |
| almohadillas absorbentes desechables | VWR | 56616-018 | |
| tijeras de disector | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| cuchillas de afeitar de doble filo | Personna | BP9020 | |
| dual automatic controlador de temperatura | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| cámara de grabación optimizada de doble superficie o flujo laminar | N/A | N/A | La cámara presentada en este protocolo está hecha a medida. Un equivalente comercial sería el RC-27L de Warner Instruments. |
| bastidor para equipos | Automate Scientific | FR-EQ70" | Un bastidor no es estrictamente necesario, pero es útil para organizar la electrofisiología |
| Etilenglicol-bis(2-aminoetiéter)- N,N,N',N'-ácido teetraacético (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| papel de filtro | Whatman | 1004 070 | |
| escala fina | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Tirador de micropipetas Flaming/Marrón | Sutter Instruments | P-97 | |
| placa de Petri de vidrio (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucosa | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosina 5′-trifosfato sodio sal hidrato | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| cubos de hielo | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| vaporizador de isoflurano | Servicios anestésicos generales | Tec 3 | |
| Fisher Scientific | 15-901-10R | ||
| papel para lentes | Fisher Scientific | 11-996 | |
| fuente de luz | Olympus | TH4-100 | |
| solución de cloruro de magnesio (1 M) | Calidad Biológico | 351-033-721EA | |
| magnético barras de agitación | Fisher Scientific | 14-513-56 | El número de catálogo dependerá del tamaño de la barra de agitación. |
| micromanipulador | Luigs & Micromanipulador Neumann | SM-5 | |
| (manual)Microscopio | Scientifica LBM-2000-00 | ||
| Microespátula | |||
| Dell | 2007FPb | ||
| La MultiClamp 700B debe incluir cabeceras, soportes para pipetas y un modelo de celda. | |||
| N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(ácido 2-etanosulfónico), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| aguja (calibre 20, 1,5 pulgadas de longitud) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| filamento de nylon | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | tamaño 0,004. Este gato. # es de Amazon.com |
| malla de nylon | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| bomba perstáltica | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Sal de fosfocreatina di(tris) | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| Soportes para pipetas | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platino | World Precision | PT0203 | |
| filamento de ácido poliláctico (PLA) | Ultimaker | RAL 9010 | |
| cloruro de potasio | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| gluconato de potasio | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| hidróxido de potasio | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| hojas de afeitar VWR | 55411-050 | ||
| pinza de rodillo | World Precision Instruments | escala 14041 | |
| Mettler Toledo | PM2000 | ||
| mango de bisturí | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| arpa de rodajas | Warner | SHD-26GH/2 | |
| bicarbonato de sodio | Fisher Chemical | S233-500 | |
| cloruro de sodio | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| fosfato de sodio monobásico anhidro | Fisher Chemical | S369-500 | |
| piruvato de sodio | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| espátula | VWR | 82027-520 | |
| espátula/cuchara, grande | VWR | 470149-442 | |
| hojas de bisturí estériles | Feather | 72044-10 | |
| agitador / placa calefactora | Corning | 6795-220 | |
| válvulas llave de paso, 1 vía | World Precision Instruments | 14054 | |
| válvulas llave de paso, 3 vías | World Precision Instruments | 14036 | |
| sacarosa | Acros Organics | AC177142500 | |
| soporte para abrazaderas giratorias Tijeras quirúrgicas | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| , afiladas/desafiladas | Fine Science Tools | Jeringa 14001-12 | |
| (1 mL) | 309659 | Becton, Dickinson | |
| (60 mL con punta Luer-Lok) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| pinza de tres puntas | Pinza de tejido Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| , grande | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| pinza de tejido, pequeña | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| pipetas de transferencia | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubo | Tygon | E-3603 | ID 1/16 pulgada, OD 3/16 pulgada |
| tubo Tygon | R-3603 | ID 1/8 pulgada, OD 1/4 pulgada | |
| grasa de vacío | Dow Corning | 14-635-5D | |
| micrótomo de cuchilla vibratoria | Leica | VT 1200S | |
| mesa de amortiguación de vibraciones con jaula de Faraday | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| matraz aforado (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| matraz aforado (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| baño de agua caliente | VWR | 1209 |
Referencias
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G.....
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Reimpresiones y permisos
