Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

Las proteínas y los ARNm que definen neuroquímicamente las subpoblaciones de neuronas se identifican comúnmente con una combinación de inmunohistoquímica (IHQ) y/o hibridación in situ (ISH), respectivamente. La combinación de ISH con técnicas IHQ facilita la caracterización de patrones de colocalización exclusivos de las neuronas funcionales (codificación neuroquímica) al maximizar la capacidad de marcaje múltiple.

Los métodos de ISH fluorescentes (FISH), incluido el ARNoscopio, tienen una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con los métodos de detección de ARN anteriores, como el ISH radiactivo y el ISH cromogénico no radiactivo. FISH permite la visualización de transcripciones individuales de ARNm como manchas teñidas punteadas¹. Además, el ensayo RNAscope permite marcar un mayor número de dianas de ARN a la vez, utilizando diferentes etiquetas de fluoróforos. A pesar de estas ventajas, las limitaciones técnicas pueden afectar al número de fluoróforos/cromógenos que se pueden utilizar en un solo experimento. Estos incluyen la disponibilidad de juegos de filtros de microscopio; estas consideraciones se agravan cuando la identificación neuroquímica utiliza la combinación de FISH e IHQ, en comparación con el uso de cada técnica de forma aislada, ya que los pasos inherentes óptimos para un método pueden ser perjudiciales para el otro.

La aplicación previa de FISH combinada con IHQ ha demostrado la expresión de dianas celulares específicas en linfomas de células B humanas², embriones de pollo³, embriones de pez cebra⁴, retina de ratón⁵ y células del oído interno de ratón⁶. En estos estudios, la preparación del tejido se realizó en parafina fijada en formol (FFPE)^2,3,5 o en montura entera fresca ^4,6. Otros estudios aplicaron el ARNoscopio cromogénico en preparaciones fijas de cerebro de ratón y rata ^7,8,9. En particular, Baleriola et al.⁸ describieron dos preparaciones tisulares diferentes para la combinación de ISH-IHC; secciones fijas del cerebro del ratón y secciones del cerebro humano FFPE. En una publicación reciente, combinamos FISH e IHQ fluorescente en secciones frescas congeladas, para visualizar simultáneamente ARNm de baja abundancia (receptor de galanina 1, GalR1), ARNm de alta abundancia (transportador de glicina 2, GlyT2) y proteína¹⁰ transportadora vesicular de acetilcolina (vAChT) en la formación reticular del tronco encefálico.

El núcleo del tracto solitario (NTS, por sus siglas en inglés) es una de las principales regiones del cerebro implicada en la función autonómica. Situada en el cerebro posterior, esta población heterogénea de neuronas recibe e integra un gran número de señales autónomas, incluidas las que regulan la respiración. El NTS alberga varias poblaciones neuronales, que pueden caracterizarse fenotípicamente por el patrón de expresión de dianas de ARNm que incluyen GalR1 y GlyT2 y marcadores proteicos para la enzima tirosina hidroxilasa (TH) y el factor de transcripción Paired-like homeobox 2b (Phox2b).

El propietario de RNAscope recomienda preparaciones de tejido fresco congelado, pero el tejido preparado por fijación de perfusión transcárdica de animal entero, junto con la crioprotección a largo plazo (almacenamiento a -20 °C) de secciones fijas de tejido congelado, es común en muchos laboratorios. Por lo tanto, se buscó establecer protocolos para la FISH en combinación con IHQ utilizando preparaciones de tejido fresco congelado y congelado fijo. Aquí, proporcionamos secciones cerebrales frescas congeladas y congeladas fijas: (1) un protocolo para FISH combinado e IHQ fluorescente (2) una descripción de la calidad del ARNm y el marcaje de proteínas producido, cuando se utiliza cada preparación (3) una descripción de la expresión de GalR1 y GlyT2 en el NTS.

Nuestro estudio reveló que, cuando se combinó con la metodología de ARNoscopio, el éxito de la IHC varió en las preparaciones frescas congeladas y congeladas fijas y dependió de la localización de las proteínas diana dentro de la célula. En nuestras manos, el marcaje de proteínas unidas a la membrana siempre tuvo éxito. Por el contrario, la IHQ para la proteína citoplasmática requirió la resolución de problemas incluso en los casos en que la proteína citoplasmática estaba sobreexpresada en un animal transgénico (Phox2b-GFP)¹¹. Finalmente, mientras que GalR1 se expresa en neuronas no catecolaminérgicas en el NTS, la expresión de GlyT2 está ausente en el NTS.

En la Figura 1 se puede encontrar un resumen de los pasos de preprocesamiento de tejidos. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con el Comité de Ética y Cuidado de los Animales de la Universidad de Nueva Gales del Sur de acuerdo con las directrices para el uso y cuidado de los animales con fines científicos (Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia).

1. Preparación de muestras de tejido cerebral fresco congelado

1. Perfusión transcárdica
   1. Preparar tampón fosfato (PB) 0,1 M heparinizado (2500 U/L), pH 7,5. Haga una suspensión de etanol de hielo seco mezclando hielo seco con etanol. Tendrá una temperatura de aproximadamente -72 °C y se utilizará para la congelación inmediata del tejido extraído.
   2. Eutanasia de ratones adultos C57BL/6 y Phox2b-GFP¹¹ (ID de la base de datos de Informática del Genoma del Ratón MGI:5776545) anestesiando con pentobarbital sódico (70 mg/kg, i.p.), utilizando un calibre de aguja de 27,5 pulgadas.
      PRECAUCIÓN: El pentobarbital es un barbitúrico. Es agudamente tóxico en dosis altas y puede causar la muerte por paro respiratorio. Consulte las pautas locales de salud, legales y de seguridad de materiales antes de usar.
   3. Exponga el corazón y canule el ventrículo izquierdo con una aguja de extracción (calibre de 23 pulgadas). Realizar perfusión transcárdica con PB heparinizado 0,1 M hasta que la sangre se aclare (2-3 minutos) a un caudal de 11-13 mL/min. Determinar la depuración sanguínea mediante el control de la coloración del hígado y el efusado de la aurícula derecha¹².
   4. Aísle el cerebro de la cavidad del cráneo, insértelo inmediatamente en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en un criomold o papel de aluminio y colóquelo en el baño de etanol de hielo seco. Guarde el tejido congelado incrustado en un recipiente hermético a -80 °C durante un máximo de 3 meses.
2. Seccionamiento de tejido fresco congelado
   1. Ajuste la temperatura del criostato a -20 °C. Deje el tejido incrustado en OCT y un mandril de criostato en el criostato durante ~ 30 minutos para permitir el equilibrio a la nueva temperatura.
      NOTA: Mantenga el pañuelo congelado en todo momento; transportar el tejido desde el congelador a -80 °C hasta el criostato en hielo seco.
   2. Asegure el tejido al mandril de criostato preenfriado con compuesto OCT. En este protocolo, los bloques de tejido se montaron en el mandril en el plano coronal.
      NOTA: Recorte el exceso de OCT del tejido, con una cuchilla de afeitar, para minimizar la cantidad de OCT que se corta con el criostato y posteriormente se transfiere al portaobjetos de vidrio.
   3. Corte secciones coronales de 14 μm de espesor y móntelas en portaobjetos de microscopía de vidrio cargados.
      1. Caliente las guías a temperatura ambiente antes de montar las secciones. Una vez montada la sección, guarde los portaobjetos en una caja de portaobjetos en el criostato.
      2. Si es necesario montar más de una sección en un portaobjetos, caliente el área para la segunda sección colocando un dedo en el lado opuesto del portaobjetos durante 5 a 10 segundos para ayudar a la adherencia de la sección al portaobjetos. Una sección de tejido frío no se adhiere a un portaobjetos frío. Las secciones deben adherirse a las diapositivas planas; Doblarlos hará que se caigan de los portaobjetos durante los pasos de lavado.
      3. Si se observan grietas en las secciones, aumente la temperatura del criostato entre 1 y 5 °C para evitarlo. Es especialmente importante colocar secciones de tejido muy cerca unas de otras en el mismo portaobjetos. Esto evitará el desperdicio de sondas y reactivos FISH durante el ensayo.
   4. Almacene las secciones de papel tisú montadas en portaobjetos de vidrio en un recipiente hermético a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
      NOTA: Mantenga las secciones congeladas en todo momento y evite los ciclos de congelación y descongelación, para evitar la degradación del ARN. Transporte la caja portaobjetos desde el interior del criostato hasta el congelador a -80 °C con hielo seco.
3. Fijación de tejido fresco congelado
   1. El día en que se vaya a realizar el ensayo de sonda FISH, prepare paraformaldehído (PFA) al 4% en PB 0,1 M, pH 7,5 (solución de PFA al 4%). Filtre pasando a través de papel de filtro (Grado 1: 11 μm, Tabla de Materiales) en un embudo Buchner o filtro de crisol.
      PRECAUCIÓN : El PFA es dañino y tóxico por contacto con la piel o inhalación. Todos los procedimientos con solución de PFA deben realizarse en un gabinete de campana extractora. Los residuos de la solución de PFA deben eliminarse con cuidado siguiendo los protocolos de seguridad institucionales.
   2. Enfriar la solución de PFA al 4% a 4 °C. Transporta el pañuelo deslizante desde el congelador a -80 °C en hielo seco y sumérgelo inmediatamente en el fijador preenfriado durante 15 minutos.
      NOTA: Es importante que este paso de fijación no supere los 15 minutos, ya que la sobrefijación dará lugar a un etiquetado de fondo no específico.
4. Deshidratación de tejido fresco congelado
   1. Deshidratar las secciones de tejido sumergiendo los portaobjetos en concentraciones graduadas de etanol. En un frasco Coplin, primero sumérjalo al 50%, luego al 70% y finalmente al etanol absoluto, durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente. Repita la incubación final de etanol absoluto por segunda vez.
   2. Seque los portaobjetos al aire y delinee el grupo de secciones con un rotulador de barrera hidrofóbico, asegurándose de que el área interna se mantenga al mínimo.
      NOTA: Asegúrese de que el portaobjetos de vidrio esté completamente seco antes de dibujar la barrera hidrofóbica. La barrera hidrofóbica debe rodear las secciones de tejido completamente sin espacios y debe estar seca antes de continuar con el procesamiento.

2. Preparación de muestras de tejido cerebral congelado fijo

1. Fijación de perfusión transcárdica
   1. Sacrificar ratones mediante anestesia con pentobarbital sódico (70 mg/kg, i.p) seguido de perfusión transcárdica, primero con 0,1 M de PB y luego con solución de PFA al 4%. Fijar con 10 minutos de perfusión a 11-13 mL/min.
   2. Aislar el cerebro de la cavidad craneal después de la fijación por perfusión y sumergir durante la noche en una solución de PFA al 4%, a 4 °C.
2. Seccionamiento tisular de tejido fijo
   1. Enjuague el cerebro con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M antes de retirar las capas meníngeas, con la ayuda de un microscopio de disección, utilizando pinzas finas.
   2. Cortar el cerebro con precisión en bloques (separar el tronco encefálico del prosencéfalo antes de seccionar el vibratome) utilizando una matriz cerebral (Tabla de materiales). Específicamente, corte el tronco encefálico caudalmente en la decusación piramidal y diseccione el cerebelo. Del mismo modo, corte el prosencéfalo inmediatamente rostral al quiasma óptico.
   3. Fije el tejido en un mandril de micrótomo vibratorio con cianoacrilato e insértelo en una solución de agar al 2%.
   4. Corte secciones de tejido de 30 μm de espesor con un micrótomo vibratorio y almacene las secciones cortadas en una solución crioprotectora (sacarosa libre de RNasa al 30%, etilenglicol al 30%, polivinilpirrolidona (PVP-40), en PB 0,1 M, pH 7,4). Las secciones de tejido pueden almacenarse en crioprotector a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
3. Preparación de secciones fijas previas a FISH
   1. El día de la pesca, lave las secciones flotantes tres veces, durante 10 minutos por lavado, para eliminar la solución crioprotectora. Para lavar, coloque las secciones en PBS de 0,1 M en una placa de cultivo celular de 12 pocillos y agite en un agitador de plataforma giratoria (90 - 100 rpm).
   2. Después de los lavados, use un pincel para montar secciones en portaobjetos de microscopía de vidrio y seque al aire durante al menos 2 horas.
      NOTA: Las secciones deben adherirse planas a los portaobjetos, ya que cualquier pliegue pronunciado hará que se desprendan durante los lavados.
   3. Con un bolígrafo de barrera hidrofóbico, dibuje una barrera alrededor de las secciones para restringir los reactivos FISH a las secciones. Una vez más, es importante minimizar el área interna del contorno dibujado con el bolígrafo barrera.
      POSIBLE PUNTO DE RUPTURA: Las secciones podrían almacenarse a temperatura ambiente, durante la noche, para continuar el ensayo al día siguiente.

3. Ensayo FISH

NOTA: El resto del protocolo se aplica tanto al tejido fresco congelado como al tejido congelado fijo.

1. Preparar los reactivos e instrumentos para las etapas de hibridación y amplificación.
   1. Ajuste una incubadora de sobremesa y un baño de agua a 40 °C.
   2. Prepare una cámara humidificada y protegida de la luz para incubar los portaobjetos. La humidificación evita el secado de los tejidos: los portaobjetos se colocan de forma segura sobre un depósito húmedo. Idealmente, la cámara está hecha de poliestireno de alta resistencia, es resistente a la luz y hermética para mantener una atmósfera saturada de vapor de agua. El cierre de la cámara se basa en una fricción mínima para evitar el movimiento. Utilizamos una caja de portaobjetos forrada con toallitas húmedas de laboratorio (Tabla de Materiales) en la parte inferior. Coloque la caja portaobjetos dentro de la incubadora para precalentarla a 40 °C.
   3. Calentar el tampón de lavado 50x (tabla de materiales) y las sondas a 40 °C durante 10 minutos, utilizando el baño de agua, y luego enfriar a temperatura ambiente.
   4. Prepare 1 L de 1x Wash Buffer a partir de la concentración de caldo 50x.
   5. Prepare la mezcla de la sonda (Tabla de materiales): la sonda C1 está lista para usar a la concentración de stock, mientras que las sondas C2 y C3 se envían con una concentración de 50x y requieren dilución con el diluyente suministrado en el kit.
      NOTA: Las mezclas de sonda pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
2. Tratamiento con proteasa
   1. Incubar secciones con Proteasa III (Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 30 minutos.
      NOTA: Asegúrese de que la proteasa III y los reactivos de incubación en los procesos posteriores (mezcla de sondas, soluciones de amplificación, tampón de bloqueo y sueros de anticuerpos) cubran las secciones por completo. Se puede usar una punta de pipeta para esparcir el reactivo sobre la sección para cubrir toda el área dentro de la barrera hidrofóbica.
   2. Lave los portaobjetos dos veces con 0,1 M PBS, durante 2 minutos cada vez, en una placa de Petri cuadrada de plástico grande. Aquí se utilizó una placa de bioensayo cuadrada de 245 mm x 245 mm (Tabla de Materiales). Sosténgalo desde un lado del plato e inclínelo suavemente de 3 a 5 veces. Después de los lavados, saque el exceso de 0,1 M PBS del portaobjetos y agregue inmediatamente el siguiente reactivo. No deje que las secciones de tejido se sequen.
      NOTA: Durante cada lavado, los portaobjetos se sumergen en solución a temperatura ambiente. Este es el flujo de trabajo para todos los pasos de lavado posteriores. Las secciones fijas de 30 μm de espesor se desprenden de los portaobjetos más fácilmente que las secciones de 14 μm de espesor, sea suave durante los lavados.
3. Hibridación y amplificación
   1. Después de lavar la solución de proteasa, coloque los portaobjetos en la cámara humidificada y precalentada. Incubar secciones con mezcla de sonda (Tabla de Materiales) durante 2 horas a 40 °C dentro de una incubadora de sobremesa.
      NOTA: Asegúrese de que haya al menos 2 secciones reservadas para sondas de control positivo y negativo para evaluar la calidad del ARN de la muestra y la permeabilización óptima. Las sondas de control positivo se dirigen a los genes de limpieza; en este caso, se trataba de un cóctel de ARN dirigidos a la ubiquitina C (UBC; alta abundancia), la peptidilpropilisomerasa B (PPIB; moderada abundancia) y la ARN polimerasa 2a (POLR2A; baja abundancia). Las sondas de control negativo se dirigen al gen bacteriano de la 4-hidroxi-tetrahidrodipicolinato reductasa (DapB), que normalmente está ausente en las muestras de cerebro de ratón. Una señal DapB positiva indica una señal no específica y/o contaminación bacteriana de la muestra.
   2. Después de la hibridación con la mezcla de sondas, los pasos de amplificación de la señal consisten en la incubación con Amp 1-FL (30 minutos), luego con Amp 2-FL (15 minutos), seguido de Amp 3-FL (30 minutos) y finalmente Amp 4-FL (15 minutos), cada uno a 40 °C. Con los frascos cuentagotas provistos, cubra las secciones de tejido con una solución de amplificación. Proceda al ensayo IHQ después del último paso de amplificación.
   3. Enjuague los portaobjetos con tampón de lavado dos veces durante 2 minutos entre la hibridación de la sonda y cada paso de amplificación.

4. Ensayo IHQ

1. Paso de bloqueo IHQ
   1. Para evitar la unión inespecífica de anticuerpos, incubar las secciones durante 1 h a temperatura ambiente con una solución de bloqueo que contenga un 10 % de suero normal de caballo, 0,3 % de Tween20 en 1x TBSm (50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,05 % de merthiolato) después del ensayo FISH. Preparar anticuerpos primarios en un tampón de dilución que contenga 1x TBSm, 5% de suero normal de caballo y 0,1% de Tween20. Los principales proveedores de anticuerpos se enumeran en la Tabla de materiales.
2. Inmunohistoquímica
   1. Eliminar el exceso de tampón de bloqueo moviendo el portaobjetos e incubar secciones con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
   2. Lavar los portaobjetos 3 veces (5 minutos cada uno) con 1x TBSm e incubar con un anticuerpo secundario en un diluyente que contenga 1x TBSm, 1% de suero normal de caballo y 0,1% de Tween20 durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.
   3. Lave los portaobjetos 3 veces con 1x TBSm (5 minutos cada uno) antes de cubrirlos con medio de montaje con o sin DAPI (Tabla de Materiales).

5. Imágenes

1. Examine la inmunotinción bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Adquiera imágenes representativas con un aumento de 20x y guárdelas como archivos TIFF.
2. Exporte imágenes representativas a un software de procesamiento de imágenes (Tabla de materiales) para ajustar el brillo/contraste para aumentar la claridad y reflejar la representación real.

6. OPCIONAL: Análisis cuantitativo de transcripciones objetivo

NOTA: Este es un artículo de métodos y no se proporcionan resultados cuantitativos. El método de cuantificación presentado aquí proviene de Dereli et al.¹⁰.

1. Adquiera imágenes de las regiones de interés como se explica en 5.1 y aplique los mismos ajustes del microscopio y de la cámara (como el tiempo de exposición y la intensidad de la luz) a todas las imágenes del mismo fluoróforo.
2. Trazar los perfiles neuronales utilizando un software de análisis de imágenes (Tabla de Materiales).
3. Alinear las secciones con referencia al nivel de Bregma de acuerdo con un atlas cerebral estereotáxico¹³.
4. Aplique el mismo brillo y contraste a todas las imágenes del mismo fluoróforo. Considere solo las neuronas con núcleos teñidos con DAPI.
5. Cuente manualmente el número de células de ARNm, que expresan proteínas, ARNm/ARNm, proteínas/proteínas y ARNm/proteínas que coexpresan dentro de la región de interés.
6. Para disminuir el sesgo en los resultados experimentales, haga que la persona que cuantifica los resultados experimentales no se ciegue a los grupos experimentales.
7. Aplique la corrección de Abercrombie¹⁴ al total de recuentos de células utilizando la siguiente ecuación de Abercombie:
   Recuento de células corregido = recuento manual de células x espesor de sección / (espesor de sección + tamaño nuclear)
   Por ejemplo, para secciones de 14 μm de espesor, se calcula que el ancho nuclear promedio es de 7,7 ± 0,3 μm y el espesor promedio de la sección es de 14 ± 1 μm basado en 30 celdas y 10 secciones respectivamente en 5 animales¹⁰. De acuerdo con la ecuación de Abercrombie, el recuento de células corregido sería el recuento manual de células x 14/(14+7,7).

Figura 1: Flujo de trabajo paralelo de los pasos de preprocesamiento de tejidos para tejidos recién congelados y fijados con paraformaldehído. Los pasos de procesamiento para el tejido fresco congelado se muestran en los cuadros con contorno rojo, mientras que los del tejido fijo con paraformaldehído (PFA) se muestran en los cuadros con contorno azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resumen de la sonda FISH combinada y el procedimiento de inmunohistoquímica. Después del preprocesamiento del tejido, el tejido montado en portaobjetos se rodea con una pluma de barrera hidrofóbica, como se ve en el primer fotograma, y se incuba en una solución de proteasa a temperatura ambiente. Después de los lavados, el tejido se transfiere a una incubadora de sobremesa para la hibridación durante 2 horas antes de los pasos de amplificación secuencial. El sistema de hibridación in situ utiliza un diseño patentado de 'sonda Z', preamplificadores y amplificadores como se ve en los fotogramas 3-6⁶. Una vez que el tejido se ha sometido al procesamiento de la sonda FISH, se lava antes de bloquearlo con suero de caballo normal. La incubación primaria de anticuerpos se lleva a cabo durante la noche a 4 °C para maximizar la unión anticuerpo-antígeno. La incubación secundaria de anticuerpos (2 horas) se realizó a temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, describimos un método para combinar FISH multiplex con IHQ fluorescente para localizar la expresión de ARNm para GalR1 y GlyT2 utilizando tejidos frescos congelados y fijados con paraformaldehído, respectivamente, en el NTS de ratón. En la Figura 1 y en la Figura 2 se muestra una línea de procesamiento de tejidos, FISH y procedimientos IHQ descritos en los métodos. La Tabla 1 proporciona un resumen de las combinaciones de sonda FISH y anticuerpos utilizadas en cada figura.

Las sondas de control se analizan de forma rutinaria al mismo tiempo que la sonda objetivo, para garantizar la integridad del flujo de trabajo y confirmar la calidad de la muestra. La ausencia de etiquetado DapB confirma la calidad e integridad de los tejidos sanos, así como la ausencia de contaminación bacteriana (Figura 3A). El marcaje de las sondas de control positivo dirigidas a la ubiquitina C (UBC, alta abundancia), la peptidilpropilisomerasa B (PPIB, abundancia moderada) y la ARN polimerasa 2a (POLR2A, baja abundancia) confirma la integridad del ARN y la señal observada entre ensayos puede utilizarse para calibrar la variabilidad entre ensayos (Figura 3B). Para validar la expresión de la sonda FISH, utilizamos tejidos de control que han sido descritos previamente para expresar la transcripción de ARNm. Por ejemplo, se confirmó que la expresión del ARNm de GalR1 es positiva en el tálamo, como se describió anteriormente10,15. Además, se verificó la distribución del ARNm de Phox2b mediante coetiquetado con el anticuerpo Phox2b; confirmamos que el marcaje FISH estaba presente solo en las neuronas que también se tiñeron positivamente con el anticuerpo Phox2b (Figura 5).

Para distinguir las neuronas GalR1+ en el NTS de los núcleos vecinos, utilizamos marcadores neuroquímicos adicionales. La inmunorreactividad de TH, Phox2b o Phox2b-GFP (Figura 4-6) y Phox2b FISH (Figura 5 y Figura 6) diferenciaron el NTS de otros núcleos en el tronco encefálico dorsal, ya que se ha informado previamente que las neuronas NTS expresan Phox2b y TH16,17. Dado que el NTS está anidado por núcleos colinérgicos, se encuentra dorsal al núcleo hipogloso y al núcleo motor dorsal del vago (DMNX), y ventral al núcleo vestibular, lo etiquetamos conjuntamente con el marcador colinérgico vAChT18 (Figura 4). Por lo tanto, se evaluó la expresión de GalR1 dentro del NTS en relación con TH y Phox2b, mientras que el marcaje con vAChT ayudó a la orientación espacial con respecto a las coordenadas rostrocaudal, dorsoventral y mediolateral. Encontramos que todas las neuronas inmunorreactivas a TH y positivas al ARNm GalR1 en el SNT eran inmunorreactivas a Phox2b-GFP, pero no todas las neuronas inmunorreactivas a Phox2b-GFP en el SNT eran inmunorreactivas a TH o positivas para ARNm GalR1 (Figura 4). Además, demostramos que el ARNm para el receptor de baja abundancia GalR1 estaba ausente en las neuronas inmunorreactivas TH y vAChT.

En preparaciones frescas congeladas, cuando se combinaron con el ensayo de sonda FISH, el éxito de la IHQ dependió de la ubicación subcelular de la proteína diana. Por ejemplo, la vAChT (una proteína unida a la membrana de la vesícula sináptica) estaba claramente inmunomarcada, mientras que la TH y la GFP (proteínas citoplasmáticas) estaban inmunomarcadas indefinidamente y solo se observaron débilmente (Figura 4). Describimos este etiquetado indefinido como "floculante" porque las células carecían de un contorno claro y resultaban difíciles de distinguir del fondo. En la misma sección de tejido fresco congelado, el marcaje de la sonda GalR1 FISH del ARNm citoplasmático de GalR1 fue puntuado y se observó claramente (Figura 4).

Además, dado que los anticuerpos TH y vAChT se elevan en el mismo huésped, ambas proteínas se marcaron utilizando el mismo anticuerpo secundario y, por lo tanto, el mismo fluoróforo de color (luz de excitación: 594). Se distinguen fácilmente por dos razones: nunca co-etiquetan en las mismas neuronas, y la localización subcelular es diferente para estas proteínas; vAChT en vesículas que presentan un aspecto punteado, y TH en el citoplasma y los procesos neuronales.

Para respaldar nuestra hipótesis de que la calidad de la IHQ (en preparados frescos congelados) depende de la localización subcelular de la proteína, comparamos el marcaje del ARNm de Phox2b (localizado en el citoplasma), la GFP (sobreexpresada en el citoplasma) y la proteína Phox2b (que se encuentra principalmente en el núcleo) en las neuronas. Como era de esperar, nuestros resultados muestran una superposición del marcaje del ARNm de Phox2b, GFP y anticuerpos Phox2b en neuronas individuales del NTS (Figura 5). Las células con marcaje citoplasmático de ARNm se correspondieron con las células que presentaban marcaje nuclear de la proteína Phox2b, lo que permitió validar el método combinado FISH-IHC. Aunque la Phox2b-GFP citoplasmática tenía un aspecto floculante, la señal nuclear de la proteína Phox2b era clara y específica. En conclusión, cuando se combinan con FISH en preparaciones frescas congeladas, las proteínas unidas a la membrana, incluidas vAChT y Phox2B, exhiben un inmunomarcaje de mayor calidad que las proteínas citoplasmáticas.

Por el contrario, la IHQ fue fiable independientemente de la localización subcelular, cuando se realizó en secciones fijas congeladas en combinación con FISH. La FISH multiplex para el ARNm de GlyT2 y el ARNm de Phox2b fue exitosa, como se muestra en la Figura 6. Las neuronas positivas para el ARNm de GlyT2 se localizaron ventralmente al SNT y no dentro del SNT. Las neuronas GlyT2+ y Phox2b+ no se colocalizaron. Una subpoblación de neuronas Phox2b+ NTS era inmunorreactiva a TH y ninguna contenía ARNm de GlyT2. Las neuronas inmunorreactivas TH son evidentes en la misma sección de tejido, exhibiendo soma y procesos neuronales marcados positivamente (Figura 6). Esto contrasta con la apariencia "floculante" de las neuronas inmunorreactivas TH en secciones frescas de tejido congelado. Por lo tanto, la preparación congelada fija descrita aquí es un método alternativo de preparación de tejidos que permite dirigirse de forma fiable a las proteínas citoplasmáticas de forma inmunohistoquímica, en combinación con el ARNoscilo.

Figura 3: Imágenes microscópicas representativas de secciones coronales del prosencéfalo de ratón a nivel del tabique lateral (Bregma 1.1 a -0.1) que muestran el marcaje de las sondas de control positivas y negativas . (A) La falta de señal después de la ISH con la 4-hidroxi-tetrahidrodipicolinato reductasa bacteriana (DapB) confirma la ausencia de señales de fondo. (B) El marcaje con sondas de control positivo dirigidas a la ubiquitina C (UBC), la peptidilpropilisomerasa B (PPIB) y la ARN polimerasa 2a (POLR2A) ilustra la señal que cabe esperar de los objetivos de abundancia alta, moderada y baja, respectivamente. Las barras de escala son de 50 μm. Todas las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 20x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes microscópicas representativas de una sección de tronco encefálico coronal congelada fresca de un ratón Phox2b-GFP que muestra el marcaje combinado de ARNm de GalR1 (FISH) y 3 proteínas (IHC) en el núcleo de la región del tracto solitario (NTS). Las inserciones en A se agrandan en B. El ARNm de GalR1 se indica mediante el marcado punteado de la sonda FISH (puntas de flecha). Los anticuerpos dirigidos a las proteínas citoplasmáticas GFP y tirosina hidroxilasa (TH) exhibieron un marcaje "floculante" (flechas). Se demuestra inmunorreactividad del transportador vesicular de acetilcolina (vAChT) (marcaje punteado rojo) en el núcleo hipogloso (XII). Las barras de escala son de 100 μm en A y 25 μm en B. Todas las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 20x. Otras abreviaturas: área postrema (AP), núcleo vestibular medial (MVe). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes microscópicas representativas de una sección de tronco encefálico coronal congelada fresca de un ratón Phox2b-GFP, que ilustran la orientación de Phox2b en el núcleo del tracto solitario (NTS) con tres enfoques diferentes: Phox2b mRNA (FISH), GFP (IHC) y proteína Phox2b (IHC). La proteína Phox2b se localiza en el núcleo. Las inserciones en A se agrandan en B. Las flechas indican neuronas que están triplemente marcadas con la sonda Phox2b (naranja-550), el anticuerpo GFP (verde-488) y el anticuerpo Phox2b (rojo-647). Las barras de escala son de 100 μm en A y 25 μm en B. Todas las imágenes se adquieren con un objetivo de 20x. Otras abreviaturas: área postrema (AP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imágenes representativas de secciones fijas congeladas del tronco encefálico coronal que demuestran el éxito de la FISH combinada con un inmunomarcaje fiable de proteínas citoplasmáticas (tirosina hidroxilasa [TH]). Doble FISH que muestra el transportador de glicina 2 (GlyT2-rojo-647, puntas de flecha llenas) y el marcaje de ARNm de Phox2b (amarillo-550, flechas) en el núcleo de la región del tracto solitario (NTS). La FISH se combinó con IHQ para la proteína TH (azul-346, puntas de flecha vacías). Las inserciones en A se agrandan en B. Las barras de escala son de 25 μm. Todas las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 20x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Sonda FISH, anticuerpos y combinaciones de fluróforos correspondientes utilizadas en las Figuras 3-6.

In the neurosciences, FISH and IHC are routinely used to investigate the spatial organization and functional significance of mRNA or proteins within neuronal subpopulations. The protocol described in this study enhances the capacity for simultaneous detection of mRNAs and proteins in brain sections. Our combined multiplex FISH-IHC assay enabled phenotypic identification of distinct neuronal subpopulations in the NTS in both fresh frozen and fixed brain preparations. FISH-IHC in fixed frozen tissue preparations produced reliable IHC outcomes. For example, multiplex FISH for low and high abundance mRNAs (GalR1 and GlyT2 respectively) and IHC (targeting tyrosine hydroxylase) revealed that GalR1 and GlyT2 are expressed in non-catecholaminergic NTS neurons. IHC for TH was not successful in fresh frozen tissue, highlighting the limited capacity for FISH-IHC in fresh frozen preparations.

ISH may be more appropriate than IHC in a range of scenarios. First, IHC may not perform well when detecting low abundance proteins, such as receptors. Using ISH to target relatively higher abundance mRNAs for these proteins improves detectability¹. Second, proteins such as neuropeptides are often trafficked to the axonal terminals following translation in the cell soma¹⁹. When neuropeptides are targeted with IHC, the axonal processes and terminals of cells label with the antibody, but not the soma, reducing the capacity to identify the cell of origin or perform quantitative analysis of the number of cells. However, since mRNAs which code for all proteins are found localized to the soma, the ISH technique is advantageous. Finally, antibodies are not readily available for some protein species, or the available antibodies are appropriate for other proteomics techniques (e.g., western blot) but not IHC. In these circumstances, mRNA labelling methods prove useful. A caveat is that mRNAs may not always be translated into protein, and so they only provide a proxy for protein identification. Since commercial FISH kits can be costly and the ISH probes are less likely to be commercially available compared to antibodies, combining FISH with IHC presents a cost and time effective strategy for increasing the number of targets that can be labelled simultaneously.

Fresh frozen versus fixed tissue preparation was a factor conferring successful IHC following FISH probe assay. We tested IHC using antibodies targeting nuclear, vesicular and cytoplasmic proteins and found reliable labelling of membrane-bound proteins (vAChT and Phox2b) on fresh frozen samples but not cytoplasmic proteins (TH and GFP). Coexpression of Phox2b protein and mRNA with 'flocculent' Phox2b-GFP labelling validated that neurons expressing the transcript also expressed the related protein, confirming the neurochemical identity of the neurons (Figure 5). In contrast, fixed frozen tissue preparations yielded reliable IHC labelling regardless of subcellular localization of the antigen. Previous studies have demonstrated that protease (e.g., pronase^8,20) pretreatment can have a detrimental effect on IHC. The contents of the protease solution utilized in the RNAscope protocol is proprietary, and permeabilization by protease is recommended for RNAscope probe access into cells. Labelling of cytoplasmic proteins using the antibodies described here has been previously verified on free floating 30 µm fixed frozen mouse brain sections^10,21,22. We slide-mounted 30 µm thick fixed samples and performed the FISH-IHC protocol, as opposed to the 14 µm thick fresh frozen sections recommended by the manufacturer. In the absence of assay modifications, or alteration of other variables (antigen retrieval, higher antibody concentration, change of protease), reliable IHC was achieved on thick, fixed samples with demonstrated labelling of the cytoplasm and axonal processes together with FISH probe labelling (Figure 6). While similar approaches were employed by other research groups^7,8,9, the current study achieved combined ISH-IHC on neurons and in a fluorescent set-up.

There were a series of critical steps in the methods to take note of. For the fresh frozen preparation, fixation time should not exceed 15 minutes; longer fixation times elicited higher background labelling. The protease step was optimized since tissues of different thickness and from various organs require different types of protease to achieve permeabilization. Fixed frozen sections adhere less to glass slides and dislodge more easily during wash steps. Hence, extra care must be taken in manual handling of fixed frozen sections, to avoid tissue loss or damage.

Although we found combined FISH and IHC to be an effective strategy, the disadvantages include cost and technically demanding assay when combining the two methods. One limitation of the study is that a side-by-side comparison of the two tissue preparation protocols was not performed. Also, our evaluation of results was limited by the number of channels the epifluorescent microscope could accommodate; the set-up allowed a maximum of 4 channels at a given time: 346, 488, 550 and 647 nm (excitation light). We were able to achieve multiplex labelling of 5 targets by labelling two proteins with different subcellular localizations using the same flurophore (Figure 4, Table 1). By using a confocal microscope, discrete excitation of many additional fluorophores may be used for individual protein labelling via IHC, or for imaging of fluorescent molecules expressed by transgenes.

Combined FISH and fluorescent IHC can reduce the reliability of each technique in isolation. In the future, we aim to improve cytoplasmic protein labelling on fresh frozen tissue with an antigen retrieval treatment²³. Previous studies show that heat induced antigen retrieval increases accessibility of the protein epitope^24,25,26. Heat treatment cleaves the crosslinks and methylol groups of the protein and unfolds the antigens in tissues, exposing epitopes which would otherwise be hidden in the tertiary protein structure under biological conditions. This accessibility may improve the success of protein labelling^26,27. Additionally, we will target different epitopes of the same cytoplasmic protein to determine if the success of protein-antibody labelling depends on the specific antibody clones used.

In conclusion, combined FISH and IHC is useful for neurochemical identification of heterogenous populations of cells in the brain, such as those in the NTS. This study presents two protocols assaying different mouse brainstem tissue preparations - fresh frozen, or fixed - for simultaneous multiplex fluorescent labelling of mRNA and proteins in situ. Both protocols may be widely applied to detect the expression pattern of low abundance mRNAs, such as GalR1. Thick (30 µm) fixed frozen preparations permeabilized with protease conferred more reliable cytoplasmic protein detection and more tissue handling challenges, when compared to thin (14 µm) fresh frozen preparations.