Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

Resumen

Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.

Resumen

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica molecular que identifica la presencia y distribución espacial de transcritos específicos de ARN dentro de las células. El fenotipado neuroquímico de neuronas identificadas funcionalmente suele requerir un marcaje concurrente con múltiples anticuerpos (proteína diana) mediante inmunohistoquímica (IHQ) y la optimización de la hibridación in situ (ARN dirigido), en conjunto. Se puede lograr una "firma neuroquímica" para caracterizar neuronas particulares, sin embargo, los factores que complican la situación incluyen la necesidad de verificar los objetivos de FISH e IHQ antes de combinar los métodos, y el número limitado de ARN y proteínas que pueden ser atacados simultáneamente dentro de la misma sección de tejido.

Aquí describimos un protocolo, utilizando preparaciones cerebrales de ratón frescas congeladas y fijadas, que detecta múltiples ARNm y proteínas en la misma sección cerebral utilizando RNAscope FISH seguido de inmunotinción de fluorescencia, respectivamente. Utilizamos el método combinado para describir el patrón de expresión de ARNm de baja abundancia (p. ej., receptor de galanina 1) y ARNm de alta abundancia (p. ej., transportador de glicina 2), en núcleos de tronco encefálico identificados inmunohistoquímicamente.

Las consideraciones clave para el etiquetado de proteínas aguas abajo del ensayo FISH van más allá de la preparación de tejidos y la optimización del etiquetado de la sonda FISH. Por ejemplo, descubrimos que la especificidad de unión y etiquetado de anticuerpos puede verse afectada negativamente por el paso de proteasa dentro del ensayo de sonda FISH. Las proteasas catalizan la escisión hidrolítica de los enlaces peptídicos, lo que facilita la entrada de la sonda FISH en las células, sin embargo, también pueden digerir la proteína objetivo del ensayo IHQ posterior, produciendo una unión fuera del objetivo. La localización subcelular de la proteína diana es otro factor que contribuye al éxito de la IHQ tras el ensayo de la sonda FISH. Observamos que la especificidad de la IHQ se conserva cuando la proteína diana está unida a la membrana, mientras que la IHQ dirigida a la proteína citoplasmática requirió una amplia resolución de problemas. Finalmente, encontramos que el manejo del tejido congelado fijo montado en portaobjetos es más desafiante que el tejido congelado fresco, sin embargo, la calidad de la IHQ fue en general mejor con el tejido congelado fijo, cuando se combinó con ARNscope.

Introducción

Las proteínas y los ARNm que definen neuroquímicamente las subpoblaciones de neuronas se identifican comúnmente con una combinación de inmunohistoquímica (IHQ) y/o hibridación in situ (ISH), respectivamente. La combinación de ISH con técnicas IHQ facilita la caracterización de patrones de colocalización exclusivos de las neuronas funcionales (codificación neuroquímica) al maximizar la capacidad de marcaje múltiple.

Los métodos de ISH fluorescentes (FISH), incluido el ARNoscopio, tienen una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con los métodos de detección de ARN anteriores, como el ISH radiactivo y el ISH cromogénico no....

Protocolo

En la Figura 1 se puede encontrar un resumen de los pasos de preprocesamiento de tejidos. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con el Comité de Ética y Cuidado de los Animales de la Universidad de Nueva Gales del Sur de acuerdo con las directrices para el uso y cuidado de los animales con fines científicos (Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia).

1. Preparación de muestras de tejido cerebral fresco congelado

1. Perfusión transcárdica
   1. Preparar tampón fosfato (PB) 0,1 M heparinizado (2500 U/L), pH 7,5. Haga una suspensión de etanol de hielo seco mezcland....

Resultados

Aquí, describimos un método para combinar FISH multiplex con IHQ fluorescente para localizar la expresión de ARNm para GalR1 y GlyT2 utilizando tejidos frescos congelados y fijados con paraformaldehído, respectivamente, en el NTS de ratón. En la Figura 1 y en la Figura 2 se muestra una línea de procesamiento de tejidos, FISH y procedimientos IHQ descritos en los métodos. La Tabla 1 proporciona un resumen de las combinaciones de sonda FISH y anti.......

Discusión

En las neurociencias, la FISH y la IHQ se utilizan de forma rutinaria para investigar la organización espacial y la importancia funcional del ARNm o las proteínas dentro de las subpoblaciones neuronales. El protocolo descrito en este estudio mejora la capacidad de detección simultánea de ARNm y proteínas en secciones cerebrales. Nuestro ensayo combinado multiplex FISH-IHC permitió la identificación fenotípica de distintas subpoblaciones neuronales en el NTS tanto en preparaciones cerebrales frescas congeladas como fijas........

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ANIMALS
C57BL/6	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 2159769
ratón Phox2b-eGFP	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 5776545
REACTIVOS
Cianoacrilato	Loctite
Etilenglicol	Sigma-Aldrich	324558
Heparina-Sodio	Clifford Hallam Healthcare	1070760	Consulte al proveedor veterinario local o a la farmacia.
Lethabarb (Pentabarbitol de Sodio) Inyección de Eutanasia	Virbac (Australia) Pty Ltd	N/A Consulte a	un veterinario para conocer las regulaciones farmacéuticas locales con respecto al Pentabarbitol de Sodio
Polvo de agarosa de grado molecular	Sigma Aldrich	5077
OCT Compuesto, 118mL	Scigen Ltd	4586
Paraformaldehído, prilado, 95%	Sigma-Aldrich	441244-1KG
Polivinilpirrolidona, promedio de moles 40,000   (PVP-40)	Sigma-Aldrich	PVP40
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930	Con o sin DAPI
RNAscope Multiplex Kit de reactivos fluorescentes (capacidad de hasta 3-plex)	Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)	ADV320850	Incluye tampón de lavado 50x y Proteasa III
RNasa Away	Thermo-Fisher Scientific	7003
Tris (hidroximetilo)aminometano	Sigma-Aldrich	252859
Tween-20, para biología molecular	Sigma-Aldrich	P9416
EQUIPMENT
sobremesa	Microincubadora Thermoline Scientific Modelo	: TEI-13G
Brain Matrix, Ratón, 30g Adulto, Coronal, 1mm	Ted Pella	15050
Cryostat	Leica	CM1950
Aguja de dibujo (calibre de 23 pulgadas)	BD	0288U07
Bolígrafo de barrera hidrofóbica	Laboratorios vectoriales	H-4000
Kimtech Science Kimwipes Toallitas para trabajos delicados	Kimberley Clark	34120
Olympus BX51	Olympus	BX-51
Bomba	peristálticaColeparmer Masterflex	L/S Series
Cámara digital Retiga 2000R Cámara digital	QImaging	RET-2000R-F-CLR	cámara color
SuperFrost Plus Portaobjetos de vidrio (blanco	)Thermo-Fisher Scientific	4951PLUS4
micrótomo vibratorio (vibrátomo)	Papel	VT1200S
Whatman, Grado 1, 110 mm de diámetro	Merck	WHA1001110
SOFTWARES
CorelDRAW	Corel Corporation	Versión 7
FIJI (ImageJ Distribution)	Código abierto/GNU Licencia Pública General (GPL)	N/A	ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ para la próxima generación de datos de imágenes científicas", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z    y Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019
a
hidroxilasa	fuerte Millipore Sigma	AB1542	Policlonal de oveja (dilución 1:1000), RRID:
AB_90755 Anticuerpo antitirosina hidroxilasa, clon LNC1	Millipore Sigma	MAB318	Monoclonal de ratón (dilución 1:1000), RRID:
AB_2201528 Anticuerpo anti-Transportador de Acetilcolina Vesicular (VAchT)	Sigma-Aldrich	ABN100	Cabra policlonal (dilución 1:1000), RRID: AB_2630394
Anticuerpo GFP	Novus Biologicals	NB600-308	Conejo policlonal (dilución 1:1000), RRID:
AB_10003058 Anticuerpo Phox2b (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-376997	Monoclonal de ratón (dilución 1:1000), RRID: AB_2813765
ANTICUERPOS SECUNDARIOS
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Conejo IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, gp, sy hms, hrs, hu, ms, rata, shp sr prot)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152	Burro anti-Conejo (dilución 1:400), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-155-147	Burro anti-Oveja (dilución 1:400), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	705-175-147	Burro anti-Cabra (dilución 1:400), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	Burro anti-Ratón (dilución 1:400), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-175-147	Burro anti-Sheep (dilución 1:400), RRID: AB_2340730
SONDAS de ARNReceptor de
glicina 2	ACDBio	409741-C3	objetivos bp 925 - 2153 (Banco de germoplasma ref: NM_148931.3)
Sonda de oligonucleótidos Phox2b	ACDBio	407861-C2	objetivos bp 1617 - 2790 (Banco de germoplasma ref: NM_008888.3)