La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz es la herramienta más valiosa en biología del desarrollo. Un problema importante en los estudios comparativos es la varianza ambiental. Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea de especímenes múltiples y, por lo tanto, trata este problema favorablemente activamente.
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Artículo de método
Imágenes simultáneas en vivo de múltiples embriones de insectos en microscopios de fluorescencia de hoja de luz basados en cámaras de muestra
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Resumen
Resumen
La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz ofrece soluciones eficientes para estudiar procesos complejos en múltiples escalas biológicamente relevantes. Las configuraciones basadas en cámaras de muestras, que están diseñadas específicamente para preservar la integridad tridimensional de la muestra y generalmente cuentan con rotación de muestras, son la mejor opción en biología del desarrollo. Por ejemplo, se han utilizado para documentar toda la morfogénesis embrionaria de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y el escarabajo de la harina roja Tribolium castaneum. Sin embargo, muchos protocolos de imágenes en vivo disponibles proporcionan solo marcos experimentales para embriones individuales. Especialmente para los estudios comparativos, tales enfoques son inconvenientes, ya que las muestras con imágenes secuenciales se ven afectadas por la varianza ambiental. Además, esto limita el número de especímenes que se pueden ensayado dentro de un tiempo determinado. Proporcionamos un marco experimental para imágenes simultáneas en vivo que aumenta el rendimiento en configuraciones basadas en cámaras de muestras y, por lo tanto, garantiza condiciones ambientales similares para todas las muestras. En primer lugar, proporcionamos una guía de calibración para microscopios de fluorescencia de láminas de luz. En segundo lugar, proponemos un método de montaje para múltiples embriones que sea compatible con la rotación de muestras. En tercer lugar, proporcionamos conjuntos de datos de imágenes en vivo tridimensionales ejemplares de Drosophila,para lo cual yuxtaponemos tres líneas transgénicas con núcleos marcados fluorescentemente, así como de Tribolium,para lo cual comparamos el rendimiento de tres sublíneas transgénicas que llevan el mismo transgén, pero en diferentes ubicaciones genómicas. Nuestro protocolo está diseñado específicamente para estudios comparativos, ya que aborda de forma proactiva la varianza ambiental, que siempre está presente en las imágenes en vivo secuenciales. Esto es especialmente importante para los análisis cuantitativos y la caracterización de fenotipos aberrantes, que resultan, por ejemplo, de experimentos knockout. Además, aumenta el rendimiento general, lo que es muy conveniente cuando el acceso a los microscopios de fluorescencia de láminas de luz es limitado. Finalmente, el método de montaje propuesto se puede adaptar para otras especies de insectos y otros organismos modelo, por ejemplo, el pez cebra, básicamente sin esfuerzo de optimización.
Introducción
La microscopía de fluorescencia es una de las técnicas de imagen más esenciales en las ciencias de la vida, especialmente en biología celular y del desarrollo. En los microscopios de fluorescencia confocal1,que son de última generación para imágenes de fluorescencia tridimensionales desde mediados de la década de 1990, la misma lente se utiliza para la excitación de fluoróforos y la detección de luz de emisión. El rayo láser de iluminación excita todos los fluoróforos a lo largo del eje de iluminación/detección y la señal de desfoque respectiva se discrimina antes de la detección por un agujero de alfiler. Por lo tanto, para cada imagen bidimen....
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Protocolo
1. Trabajos preparatorios
- Elija una combinación de lente de iluminación/lente de detección/cámara para el LSFM que se adapte a la pregunta científica y configure el microscopio. El tamaño del campo de visión es el cociente del tamaño del chip de la cámara y el aumento de la lente de detección. La lente de iluminación debe elegirse de modo que todo el campo de visión esté cubierto por una hoja de luz aproximadamente plana34. En la Tabla 1se enumeran tres combinaciones recomendadas.
- Para preparar alícuotas de agarosa y platos de recuperación, agregue 2 g de agarosa de baja fusión a 200 mL de agua del grifo en ....
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Resultados
Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva de la fluorescencia comparativa en LSFMs basado cámara de la muestra. Por ejemplo, el marco se puede utilizar para yuxtaponer (i) embriones de dos o más especies, (ii) embriones de líneas en las que uno o más genes son eliminados más controles de tipo salvaje, (iii) múltiples embriones de la misma línea transgénica, (iv) embriones de diferentes líneas transgénicas, o (v) embriones de sublíneas que portan el mismo transgén , pero en diferen.......
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Discusión
Una de las áreas de aplicación exclusivas de LSFMs es la biología del desarrollo. En esta disciplina, es importante observar especímenes vivos, de lo contrario los procesos morfogenéticos no se pueden describir de manera dinámica. Un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea en LSFMs cámara-basados de la muestra, según lo descrito aquí, es conveniente por dos razones principales.
La varianza ambiental, que es inevitable en imágenes en vivo secuenciales, se puede abordar d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Ernst H. K. Stelzer por la oportunidad de utilizar sus recursos, así como sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, Anita Anderl por su apoyo con las imágenes en vivo de Tribolium, Sven Plath por el apoyo técnico, así como a Ilan Davis, Nicole Grieder y Gerold Schubiger por compartir sus líneas transgénicas de Drosophila a través del Bloomington Stock Center.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 6 pocillos | Orange Scientific | 4430500 | Placa |
| 24 pocillos | Orange Scientific | 4430300 | Solo para imágenes en vivo que involucran Tribolium |
| 35-mm y Oslash; Placa de Petri | Fisher Scientific 153066 | Solo para imágenes en vivo que involucran Drosophila. | |
| 90 mm y barra osta; Placa de Petri | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µ m tamaño de malla filtro | de células BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µ tamiz de tamaño de malla m | VWR International | 200.025.222-038 | Solo para imágenes en vivo con Tribolium |
| 300 y micro; tamiz de tamaño de malla m | VWR International | 200.025.222-040 | Solo para imágenes en vivo con Tribolium |
| 710 y micro; tamiz de tamaño de malla m | VWR International | 200.025.222-050 | Solo para imágenes en vivo con Tribolium |
| 800 y micro; tamiz de tamaño de malla m | VWR International | 200.025.222-051 | Solo para imágenes en vivo con harina de trigo fina Tribolium |
| 405 | Demeter e.V. | SP061006 | Solo para imágenes en vivo que involucren medio de Drosophila Tribolium |
| disponible comercialmente | Genesee Scientific | 66-115 | Solo para imágenes en vivo que involucren Drosophila / También se pueden usar |
| microesferas fluorescentes, 1.0 y micro> hechas a medida Drosophila | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| levadura seca inactiva | Genesee Scientific | 62-108 | |
| agarosa de bajo punto de fusión | Carl Roth | 6351.2 | |
| viales estrechos | Genesee Scientific | 32-109 | Solo para imágenes en vivo con Drosophila |
| small pincel | VWR International | 149-2121 | |
| hipoclorito de sodio (NaOCl), ~12% Cl activo Carl | Roth | 9062.3 | Precaución: el hipoclorito de sodio es corrosivo |
| harina de trigo integral | Demeter e.V. | SP061036 | Solo para imágenes en vivo con Tribolium / Reino Unido: |
| viales anchos de | Genesee Scientific | 32-110 | Solo para imágenes en vivo que involucran Drosophila |
Referencias
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of....
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