Aquí describimos dos protocolos: primero para propagar, extraer, purificar y cuantificar grandes cantidades de partículas de virus no envueltas de abejas melíferas, incluido un método para eliminar las pupas de abejas melíferas y segundo para probar los efectos de la infección viral utilizando un bioensayo de jaula altamente repetible y de alto rendimiento.
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Artículo de método
Preparación de inóculo enriquecido con virus para la infección oral de abejas melíferas (Apis mellifera)
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Resumen
Resumen
Las abejas melíferas son de gran importancia ecológica y agrícola en todo el mundo, pero también están sujetas a una variedad de presiones que afectan negativamente la salud de las abejas, incluida la exposición a patógenos virales. Tales virus pueden causar una amplia variedad de efectos devastadores y, a menudo, pueden ser difíciles de estudiar debido a múltiples factores que dificultan la separación de los efectos de los tratamientos experimentales de la infección de fondo preexistente. Aquí presentamos un método para producir en masa grandes cantidades de partículas de virus junto con un bioensayo de alto rendimiento para probar la infección viral y los efectos. Necesarias por la falta actual de una línea celular de abejas melíferas continua y libre de virus, las partículas virales se amplifican in vivo utilizando pupas de abejas melíferas, que se extraen de la colmena en grandes volúmenes utilizando una metodología mínimamente estresante. Estas partículas de virus se pueden usar en bioensayos de jaulas de abejas melíferas para probar la viabilidad de los inóculos, así como varias otras dinámicas de infección por virus, incluidas las interacciones con la nutrición, los pesticidas y otros patógenos. Una ventaja importante del uso de tales partículas es que reduce en gran medida las posibilidades de introducir variables desconocidas en la experimentación posterior en comparación con las alternativas actuales, como la infección a través de la hemolinfa de abeja infectada u homogeneización, aunque aún se debe tener cuidado al obtener las abejas, para minimizar la contaminación del virus de fondo. Los ensayos en jaulas no son un sustituto de los experimentos a gran escala y realistas en el campo que prueban los efectos de la infección por virus a nivel de colonia, sino que funcionan como un método para establecer respuestas virales de referencia que, en combinación con las partículas de virus semipuras, pueden servir como herramientas importantes para examinar varias dimensiones de las interacciones fisiológicas entre la abeja melífera y el virus.
Introducción
Las abejas melíferas (Apis mellifera) desempeñan un papel fundamental en el panorama agrícola mundial moderno, pero actualmente sufren de una combinación de factores estresantes bióticos y abióticos, incluida la exposición a pesticidas, forraje deficiente, parásitos y patógenos 1,2. Uno de los patógenos más importantes de preocupación son los virus, muchos de los cuales son vectorizados por otro de los principales factores estresantes de las abejas melíferas, el ácaro parásito Varroa (Varroa destructor). Estos virus pueden causar una serie de efectos negativos en las abejas melíferas, incluid....
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Protocolo
1. Opción de extracción masiva de abejas 1: autoeliminación de larvas
- Enjaula a una reina abeja melífera en un marco langstroth vacío y prolongado y devuélvela a su colonia. Deje que la reina ponga huevos en este marco durante 24 h.
- Revise el marco después de 24 h para asegurarse de que la mayoría de las células del peine contengan huevos recién puestos. Dependiendo de la reina y la colonia, los huevos a veces no se ponen muy bien en las primeras 24 h. Si esto ocurre, espere 24 horas adicionales y ajuste el tiempo según sea necesario.
- Después del período de puesta de huevos de 24 h, libere a la reina. Marque el marco claramente ....
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Resultados
Seguir con éxito los protocolos (Figuras 1) para la inyección de pupas y la extracción viral debe producir grandes cantidades de partículas de virus. Sin embargo, el muestreo y la inyección de pupas procedentes de una variedad de colonias en múltiples puntos de tiempo maximiza las posibilidades de adquirir el virus objetivo con baja contaminación. La dinámica por la cual los virus se replican e interactúan entre sí dentro de una abeja melífera no se entiende bien; junto con la probabilidad de infección p.......
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Discusión
Aquí hemos esbozado métodos que detallan cada paso del proceso de amplificación del virus y preparación de la población de inóculos, incluida la recolección de larvas y la propagación, extracción y concentración del virus, así como el tratamiento viral en forma de experimentos de alimentación en jaulas. Estos métodos permiten la producción de partículas de virus semipuras (Figura 4), cuya eficacia puede cuantificarse consistentemente mediante pruebas de mortalidad dosis-respuesta para virus .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a la Dra. Julia Fine por sus ideas y discusión durante el proceso de creación del protocolo, así como a la Dra. Cassondra Vernier por sus útiles comentarios a lo largo de la edición. Estos materiales contribuyeron a proyectos que fueron apoyados en parte por la Fundación para la Investigación de la Alimentación y la Agricultura, bajo la subvención ID 549025.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| lejía al 10% | |||
| Cloroformo 24:1:Alcohol isoamílico | SigmaAldrich | C0549 | |
| etanol al 70% | |||
| Jaulas para bioensayo | Dependiendo de la configuración experimental | ||
| Combitips Advanced 0.1 mL | Eppendorf 30089405 | Opcional (si no hay ropa inyectora disponible) | |
| Recipientes para la autoextracción | Deben medir aproximadamente 19" x 9-1/8" (dimensiones del marco profundo de Langstroth) | ||
| Pinzas | Pinzas romas y blandas para la separación de larvas; Pinzas romas y duras para la escisión de la pupa | ||
| Incubadora | |||
| C y 50% de humedad relativa | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | Cualquier toallita absorbente funcionará |
| Barcos | Sirven como bandejas de inóculo | ||
| Microcon-100kDa con membrana Biomax | MilliporeSigma | MPE100025 | |
| NaCl | |||
| Guantes | |||
| Fosfato solución salina tamponada (PBS) | SigmaAldrich | P5119 | |
| Polietilenglicol 8000 (PEG) | SigmaAldrich | 1546605 | |
| Centrífuga | Capaz de 15.000 x g | ||
| Centrífuga | Capaz de 21.000 x g | ||
| Repetidor M4 Multipipeta | Eppendorf 4982000322 | Opcional (si no hay aplicación de inyector disponible) | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000TS1 | |
| Agua sin ARNasa | SigmaAldrich | W4502 | |
| Sacarosa | |||
| TES | SigmaAldrich | T1375 |
Referencias
- vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
- Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L.
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Reimpresiones y permisos
