Artículo de método

Inyección intravítrea y cuantificación de parámetros de infección en un modelo de ratón de endoftlomitis bacteriana

DOI:

10.3791/61749

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6 de febrero de 2021

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí describimos un método de inyección intravítrea y posterior cuantificación bacteriana en el modelo de ratón de endoftalmitis bacteriana. Este protocolo se puede extender para medir las respuestas inmunitarias del huésped y la expresión génica bacteriana y del huésped.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las infecciones bacterianas intraoculares son un peligro para la visión. Los investigadores utilizan modelos animales para investigar los factores huésped y bacteriano y las vías de respuesta inmune asociadas con la infección para identificar dianas terapéuticas viables y para probar fármacos para prevenir la ceguera. La técnica de inyección intravítrea se utiliza para inyectar organismos, fármacos u otras sustancias directamente en la cavidad vítrea en el segmento posterior del ojo. Aquí, demostramos esta técnica de inyección para iniciar la infección en el ojo del ratón y la técnica de cuantificación de bacterias intraoculares. Bacillus cereus se creció en medios líquidos de infusión de corazón cerebral durante 18 horas y resuspended a una concentración de 100 unidades formadoras de colonias (CFU) / 0,5 l. Un ratón C57BL/6J fue anestesiado usando una combinación de ketamina y xilazina. Usando un microinyector picolitr y agujas capilares de vidrio, se inyectó 0,5 l de la suspensión de Bacillus en el vítreo medio del ojo del ratón. El ojo de control contralateral se inyectó con medios estériles (control quirúrgico) o no se inyectó (control absoluto). A las 10 horas después de la infección, los ratones fueron eutanasiados, y los ojos fueron cosechados usando pinzas quirúrgicas estériles y colocados en un tubo que contiene 400 l de PBS estéril y perlas de vidrio estériles de 1 mm. Para elISA o ensayos de mieloperoxidasa, se añadió inhibidor de la proteinasa a los tubos. Para la extracción de ARN, se agregó el búfer de lelisis adecuado. Los ojos se homogeneizaron en un homogeneizador de tejido durante 1-2 minutos. Los homogeneados se diluyeron en serie 10 veces en PBS y la pista se diluyó en placas de agar. El resto de los homogeneizas se almacenaron a -80 oC para ensayos adicionales. Las placas se incubaron durante 24 horas y se cuantificó la CFU por ojo. Estas técnicas resultan en infecciones reproducibles en los ojos del ratón y facilitan la cuantificación de bacterias viables, la respuesta inmune del huésped y la omica de la expresión génica del huésped y del bacteria.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La endoftalmitis bacteriana es una infección devastadora que causa inflamación y, si no se trata adecuadamente, puede provocar pérdida de la visión o ceguera. La endoftalmitis es el resultado de la entrada de bacterias en el interior del ojo1,2,3,4,5. Una vez en el ojo, las bacterias se replican, producen toxinas y otros factores nocivos, y pueden causar daños irreversibles a las delicadas células y tejidos de la retina. El daño ocular también puede ser causado por inflamación, debido a la activación de vías inflamatorias que conducen a la entrada de células inflamatorias en el interior del ojo1,5,6. La endoftalmitis puede ocurrir después de una cirugía intraocular (postoperatoria), una lesión penetrante en el ojo (postraumático) o por propagación metastásica de bacterias en el ojo desde un sitio anatómico diferente (endógeno)7,8,9,10. Los tratamientos para la endoftalmitis bacteriana incluyen antibióticos, medicamentos antiinflamatorios o intervención quirúrgica3,4,11. Incluso con estos tratamientos, la visión o el propio ojo pueden perderse. El pronóstico visual después de la endoftalmitis bacteriana generalmente varía dependiendo de la eficacia del tratamiento, la agudeza visual en la presentación y la virulencia del organismo infectante.

Bacillus cereus (B. cereus) es uno de los principales patógenos bacterianos que causa endoftalmitis postraumática7,12. La mayoría de los casos de endoftalmitis de B. cereus tienen un curso rápido, lo que puede resultar en ceguera en pocos días. Las señas de identidad de B. cereus endophthalmitis incluyen inflamación intraocular en rápida evolución, dolor ocular, pérdida rápida de agudeza visual y fiebre. B. cereus crece rápidamente en el ojo en comparación con otras bacterias que comúnmente causan infecciones oculares2,4,12 y posee muchos factores de virulencia. Por lo tanto, la ventana para la intervención terapéutica exitosa es relativamente corta1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Los tratamientos para esta infección suelen tener éxito en el tratamiento de la endoftalmitis causada por otros patógenos menos virulentas, pero la endoftalmitis de B. cereus suele dar lugar a más del 70% de los pacientes que sufren de pérdida significativa de la visión. Alrededor del 50% de esos pacientes se someten a evisceración o enucleación del ojo infectado7,16,22,23. La naturaleza destructiva y rápida de B. cereus endophthalmitis requiere un tratamiento inmediato y adecuado. Los recientes progresos en el discernimiento de los mecanismos subyacentes del desarrollo de enfermedades han identificado objetivos potenciales para la intervención19,26,27. Los modelos experimentales de ratón de B. cereus endophthalmitis siguen siendo útiles para discernir los mecanismos de infección y probar posibles terapias que pueden prevenir la pérdida de la visión.

La infección intraocular experimental de ratones con B. cereus ha sido un modelo instrumental para comprender los factores bacterianos y de acogida, así como sus interacciones, durante la endoftalmitis28. Este modelo imita un evento postraumático o postoperatorio, en el que las bacterias se introducen en el ojo durante una lesión. Este modelo es altamente reproducible y ha sido útil para probar terapias experimentales y proporcionar datos para mejoras en el estándar de atención1,6,19,29,30. Al igual que muchos otros modelos de infección, este modelo permite el control independiente de muchos parámetros de infección y permite un examen eficiente y reproducible de los resultados de la infección. Los estudios en un modelo similar en conejos en las últimas décadas han examinado los efectos de los factores de virulencia de B. cereus en los ojos2,4,13,14,31. Mediante la inyección de cepas mutantes de B. cereus que carecen de factores de virulencia individuales o múltiples, la contribución de estos factores de virulencia a la gravedad de la enfermedad se puede medir mediante resultados tales como la concentración de bacterias en diferentes horas de postinfección o la pérdida de la función visual13,14,27,31,32. Además, los factores anfitriones se han examinado en este modelo infectando cepas de ratón knockout que carecen de factores de acogida inflamatorios específicos26,29,33,34,35. El modelo también es útil para probar posibles tratamientos para esta enfermedad mediante la inyección de nuevos compuestos en el ojo después de la infección30,36. En este manuscrito, describimos un protocolo detallado que incluye infectar un ojo de ratón con B. cereus,cosechar el ojo después de la infección, cuantificar la carga bacteriana intraocular y preservar muestras para ensayar parámetros adicionales de la gravedad de la enfermedad.

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Protocolo

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Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y De la Visión. Los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma (números de protocolo 15-103, 18-043 y 18-087).

1. Agujas de vidrio estériles

  1. Encienda el tirador de la pipeta de la aguja.
  2. Ajuste la perilla del calentador hasta que la pantalla muestre 12.6.
  3. Abra la puerta y alimente manualmente el tubo capilar de 5 l a través de la abrazadera superior y el filamento del calentador hasta que la mitad del tubo se extienda por debajo del filamento (Figura 1A).
  4. Confirme que el tubo capilar está en la ranura "V" de la abrazadera superior. Apriete la abrazadera superior.
  5. Con la abrazadera inferior abierta, ajuste manualmente la diapositiva vertical hacia arriba hasta que la abrazadera inferior alcance su límite superior. Confirme que el tubo está en la ranura "V" de la abrazadera inferior. Apriete la abrazadera inferior.
  6. Cierre la puerta y confirme que la luz "Listo" está encendida. Pulse el botón Inicio para iniciar el calentador y la secuencia de tracción(Figura 1B).
  7. Asegúrese de que el calentador se apague automáticamente después de que el calor y la gravedad separan el tubo capilar(Figura 1C),y la diapositiva se mueve hacia abajo.
  8. Abre la puerta. Mientras sostiene la parte superior del tubo capilar, desapreomezca la abrazadera superior. Retire el tubo capilar superior y dejólo a un lado.
  9. Sujete el tubo capilar en la corredera inferior y desapreomezca la abrazadera inferior. Retire el tubo capilar inferior y dejólo a un lado.
  10. Utilice un biselado de microelectrodo con una placa de molienda abrasiva de alúmina de 0,05 m para biselar el tubo capilar tirado para crear las agujas de inyección.
  11. Pipetear suficiente agua sobre la placa de molienda para cubrir la superficie(Figura 1D).
  12. Encienda el beveller para que comience a girar a 60 rpm. Coloque el tubo capilar tirado en la abrazadera de la pipeta en la ranura "V". Apriete la abrazadera y ajuste el ángulo de la abrazadera de la pipeta a 30o.
  13. Ajuste la punta del borde puntiagudo del tubo capilar a una distancia de aproximadamente dos tercios del centro de rotación de la placa de molienda.
  14. Baje el tubo capilar sujetado ajustando la perilla de control gruesa en la parte superior del manipulador. Continúe bajando el tubo capilar hasta que la punta del tubo capilar se extienda por debajo de la superficie del agua y entre en contacto con la superficie abrasiva de la placa de molienda.
  15. Supervise el progreso del biselado utilizando el microscopio conectado al beveller. Después de 5 minutos, ajuste el control fino para elevar la aguja de vidrio de la placa de molienda.
  16. Retire la aguja de vidrio y colóquela debajo de un aumento de 10x para comprobar la punta del tubo capilar(Figura 1E,F).
  17. Para asegurarse de que no haya obstrucciones, inserte la aguja de vidrio en un soporte de pipeta en una jeringa y empuje el aire en un tubo de 1 ml de etanol al 99%. Si se forman burbujas de aire en la punta de la aguja, la aguja no tiene obstrucciones y se puede utilizar para la microinyección. Este proceso también asegura la esterilidad de las agujas de vidrio.
  18. Un tubo capilar puede contener hasta 5 l de líquido. Marque el tubo capilar en 10 secciones para calcular las distancias en la aguja para marcar para volúmenes de 0,5 l. Marque una escala con esa distancia que mantenga 0,5 ml para la preparación futura. Para una aguja de 5 l, las distancias de 0,7 mm de separación equivalen a 0,5 l(Figura 1G).

2. Cultivo de Bacillus cereus

  1. Realice todos los procedimientos de esta sección en condiciones de nivel 2 de Bioseguridad.
  2. Stock congelador de rayas de B. cereus ATCC 14579 para aislamiento de una sola colonia en una placa de agar de sangre de oveja del 5% e incubar durante la noche a 37oC(Figura 2A).
  3. Pipeta 5 mL de caldo estéril de infusión de corazón cerebral (BHI) en un tubo de tapa estéril de 10 ml(Figura 2B). Usando un lazo estéril o aguja, escoja una sola colonia de B. cereus ATCC 14579 de la placa de agar e inocular el líquido BHI.
  4. Vórtice la muestra brevemente. Coloque el tubo de tapa de presión en una incubadora giratoria. Ajuste la temperatura a 37 oC y acelere a 200 rpm. Después de 18 h, retire el cultivo de la incubadora(Figura 2B).

3. Dilución bacteriana para inyección intravítrea

  1. Realice todos los procedimientos de esta sección en condiciones de nivel 2 de Bioseguridad.
  2. Calcular el volumen del cultivo nocturno de B. cereus para añadir a 10 ml de BHI fresco para lograr 200 unidades formadoras de colonias por microlitro (CFU/L). Por ejemplo, un cultivo nocturno de B. cereus en BHI se replica en aproximadamente 2 x 108 CFU/ml, que luego se puede diluir a 200 UFC/L mediante pipeteo de 10 ml de cultivo nocturno en 10 ml de BHI fresco.
  3. Pipetear 1 ml del cultivo recién diluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga este tubo sobre hielo hasta la inyección intravítrea. Realizar la inyección intravítrea dentro de 60 min de diluir el cultivo bacteriano.

4. Inyección intravítrea del ratón

  1. Realice todos los procedimientos de esta sección en condiciones de nivel 2 de Bioseguridad.
  2. Prepare el sitio del procedimiento colocando los paneles inferiores médicos en la mesa de operaciones.
  3. Encienda el microinyector y abra la válvula de gas en el tanque de aire comprimido conectado al microinyector. Ajuste el regulador del tanque hasta que la entrega de gas sea de aproximadamente 60 psi.
  4. En el microinyector, pulse Modo hasta que la pantalla muestre Equilibrio. Pulse Balance y coloque el ratón del ordenador en la mesa de operaciones. Conecte el soporte de pipeta de acero inoxidable al tubo conectado a 'Fill/Output' del inyector. Este tubo siempre está conectado al inyector.
  5. Inserte la aguja capilar en el otro extremo del soporte de la pipeta atornillando firmemente el conector del soporte de la pipeta alrededor de la aguja.
  6. Encienda el microscopio oftálmico y encienda su luz a una intensidad del 50%. Ajuste el microscopio sobre el sitio del procedimiento en la mesa de operaciones y ajuste el microscopio al foco deseado.
  7. Antes de que comience el procedimiento, confirme que el ratón está adecuadamente anestesiado probando el reflejo de abstinencia del pedal. Asegúrese de seguir su protocolo aprobado por la IACUC para la anestesia.
  8. Coloque el ratón anestesiado en las almohadillas inferiores médicas con la nariz apuntando a la derecha y apoyado en su lado izquierdo.
  9. Mire el ojo derecho del ratón a través del microscopio oftálmico y abra los párpados abriendo las pinzas de una acción inversa a cada lado del ojo para exponer el lugar de inyección (Figura 3C).
  10. Llene la aguja capilar con la dilución de 200 CFU/L haciendo clic izquierdo en la almohadilla del ratón conectada al microinyector (Figura 3D).
  11. Asegure la cabeza del animal con la mano izquierda y coloque la punta de la aguja en el limbo del ojo. Con la aguja en la posición de bisel hacia arriba y en ángulo de 45o, perfore el ojo del ratón, pero asegúrese de que sólo se inserta la punta afilada de la aguja (0,5 mm) al inyectar.
  12. Una vez insertada la punta de la aguja, mueva la mano izquierda de la cabeza del ratón a la almohadilla del ratón y haga clic con el botón derecho en la almohadilla del ratón para inyectar 0,5 l de la dilución de B. cereus. Para evitar fugas, deje la punta de la aguja dentro del ojo del ratón durante 2-3 segundos antes de retirar (Figura 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Suelte los fórceps y coloque el ratón en una jaula que esté sentada en una almohadilla de calentamiento. Monitoree estos ratones hasta que se hayan recuperado de la anestesia(Figura 3F).
  14. Una vez que los ratones se recuperan de la anestesia, devuelva la jaula a su estante adecuado. Si los ratones serán sometidos a análisis de la función de la retina por electrorretinografía, las jaulas deben ser devueltas a una habitación oscura para una adecuada adaptación oscura.

5. Preparación del tubo de cosecha

  1. Coloque perlas de vidrio estéril de 1 mm en tubos de tapa de tornillo de 1,5 ml.
  2. Esterilice estos tubos en un autoclave en un ajuste seco. Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente antes de usarlos.
  3. Añadir 10 ml de 1x solución salina estéril tamponada por fosfato (PBS) a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml.
  4. Añadir 1 comprimido de comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa en el tubo. Mezclar por vórtice19,27,29,34,35.
  5. Pipetear 400 l de 1x solución salina tamponada por fosfato (PBS) que contiene inhibidor de la proteasa en cada tubo de cosecha autoclavedo. Etiquete los tubos y colóquelos sobre hielo. (Figura 4A).

6. Cosecha de los ojos

  1. Realice todos los procedimientos de esta sección en condiciones de nivel 2 de Bioseguridad.
  2. Eutanasia el ratón por inhalación de CO2. Utilice un método secundario para confirmar la eutanasia.
  3. Sostenga la cabeza del ratón eutanizado firme y abra los fórceps de punta fina a cada lado del ojo infectado. Empuje hacia abajo hacia la cabeza para apuntalar el ojo. Una vez que las pinzas estén detrás del globo del ojo, apriete las pinzas. Tire de los fórceps de la cabeza para separar el globo ocular (Figura 4B).
  4. Coloque inmediatamente el globo ocular en un tubo de cosecha etiquetado. Coloque los tubos sobre hielo durante no más de 60 minutos(Figura 4C).

7. Recuento bacteriano intraocular

  1. Realice todos los procedimientos de esta sección en condiciones de nivel 2 de Bioseguridad.
  2. Confirme que todos los tubos de cosecha están herméticamente cerrados y están equilibrados mientras están en el homogeneizador de tejido (Figura 5A). Encienda el homogeneizador de tejido durante 1 min para homogeneizar las muestras. Espere 30 s y, a continuación, encienda un minuto más. Colocar tubos sobre hielo (Figura 5B,C).
  3. Diluir en serie cada muestra 10 veces mediante la transferencia secuencial de 20 l del homogeneato a 180 l de 1x PBS estéril. Diluir hasta alcanzar un factor de10 -7 (Figura 5D).
  4. Etiquete cada fila de una placa BHI cálida y cuadrada con los factores de dilución adecuados. Transfiera 10 l de cada dilución en una fila a la placa BHI superior que esté inclinada aproximadamente 45o. Deje que la muestra se ejecute hasta que casi llegue a la parte inferior de la placa, luego ponga la placa plana (Figura 5E)39.
  5. Cuando la muestra se absorba en el agar BHI, transfiera la placa a una incubadora de 37oC. Las colonias deben comenzar a ser visibles 8 h después de ser colocadas en la incubadora.
  6. Retirar la placa de la incubadora antes del crecimiento de las colonias de B. cereus interfiere con la identificación de colonias individuales (Figura 5F).
  7. Para una representación precisa de la concentración en la muestra, cuente la fila que tiene entre 10-100 colonias. Por ejemplo, una fila con la fracción de dilución de 10-4 que tiene 45 colonias tendrá una concentración de 4,5 x 105 CFU/ml.
  8. Para calcular el número total de bacterias por ojo, multiplique la concentración por 0,4, que representa el volumen de mililitros de 1x PBS utilizado para homogeneizar el ojo. Por ejemplo, la concentración de 4,5 x10 5 UFC/ml se traduciría en 1,8 x 105 CFU B. cereus por ojo.

8. Preservación de muestras

  1. Coloque las muestras homogeneadas en una caja de congelador etiquetada y coloque esta caja en un congelador de -80 oC. Estas muestras se pueden utilizar más adelante para el análisis de mediadores inflamatorios por ELISA.

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Resultados

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La generación de un inóculo reproducible y la precisión del procedimiento de inyección intravítrea son pasos clave en el desarrollo de modelos de endoftalmitis microbiana. Aquí, demostramos el procedimiento de inyección intravítrea usando Gram-positivo Bacillus cereus. Inyectamos 100 UFC/0,5 l de B. cereus en el medio vítreo de cinco ratones C57BL6. Después de 10 h postinfección, observamos crecimiento intraocular de B. cereus a aproximadamente 1,8 x 105 CFU/ojo.

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Discusión

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Incluso con la disponibilidad de antibióticos potentes, medicamentos antiinflamatorios y cirugía de vitrectomía, la endoftalmitis bacteriana puede cegar a un paciente. Los estudios clínicos han sido útiles en el estudio de la endoftalmitis; sin embargo, los modelos experimentales de endoftalmitis proporcionan resultados rápidos y reproducibles que se pueden traducir al progreso en el estándar de atención, lo que resulta en un mejor resultado visual para los pacientes.

El volumen vítreo del ojo...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos financieros que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen al Dr. Feng Li y Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) por su ayuda. Nuestra investigación ha sido apoyada por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 y R01EY024140. Nuestra investigación también ha sido apoyada por P30EY21725 (beca NIH CORE para imágenes y análisis de animales vivos, biología molecular e imágenes celulares). Nuestra investigación también ha sido apoyada por el programa de entrenamiento predoctoral NEI Vision Science 5T32EY023202, una beca de apoyo a la investigación de la Fundación Presbiteriana de Salud y una subvención sin restricciones al Dean A. McGee Eye Institute de Investigación para Prevenir la Ceguera.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-20 y micro; Pipeta LRANINL0696003GNA
37oC IncubadoraFisher Scientific11-690-625DNA
Bacto Brain Heart InfusionBD90003-032NA
Cell MicroinjectorMicroData Instrument, Inc.PM2000NA
Pinzas de punta finaThermo Fisher Scientific12-000-122NA
Perlas de vidrio 1.0 mmBioSpec11079110NA
Incubadora ShakerNew Brunswick ScientificNB-I2400NA
Pipetas microcapilares 5 MicrolitrosKimble71900-5NA
Micro-Pipeta BiseladoraSutter Instrument Co.BV-10
NA Microscopio Axiostar PlusZeissNA
Microscopio OPMI LumeraZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModelo 607NA
Pipeta multicanal 30-300 µ LBiohit15626090NA
Pipeta multicanal 5-100 µ LBiohit9143724NA
Extractor de Agujas/PipetasKopf730NA
PBSGIBCO
inhibidores de proteasaRoche 4693159001Pinza
acción inversaKatenaK5-8228NA
1897315 Cóctel de de grado molecular de de grado molecular

Referencias

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