Cuantificación de los efectos de los antimicrobianos en la arquitectura de biopelículas in vitro mediante el software COMSTAT

Resumen

Los cambios inducidos por antimicrobianos en la arquitectura de la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa difieren entre los aislados clínicos cultivados de pacientes con fibrosis quística e infección pulmonar crónica. Después de la microscopía confocal, el software COMSTAT se puede utilizar para cuantificar las variaciones en la arquitectura de la biopelícula (por ejemplo, área de superficie, espesor, biomasa) para aislados individuales para evaluar la eficacia de los agentes antiinfecciosos.

Resumen

Las biopelículas son agregados de microorganismos que dependen de una matriz autoproducida de sustancia polimérica extracelular para su protección e integridad estructural. Se sabe que el patógeno nosocomial, Pseudomonas aeruginosa, adopta un modo de crecimiento de biopelícula, causando infección pulmonar crónica en pacientes con fibrosis quística (FQ). El programa informático, COMSTAT, es una herramienta útil para cuantificar los cambios inducidos por antimicrobianos en la arquitectura de la biopelícula de P. aeruginosa mediante la extracción de datos de imágenes confocales tridimensionales. Sin embargo, el funcionamiento estandarizado del software se aborda con menos frecuencia, lo cual es importante para la generación óptima de informes sobre el comportamiento de la biopelícula y la comparación entre centros. Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar un marco simple y reproducible para cuantificar estructuras de biopelículas in vitro en diferentes condiciones antimicrobianas a través de COMSTAT. La técnica se modela utilizando un aislado de CF P. aeruginosa , cultivado en forma de réplicas de biopelícula y expuesto a tobramicina y al anticuerpo monoclonal anti-Psl, Psl0096. El enfoque paso a paso tiene como objetivo reducir la ambigüedad del usuario y minimizar la posibilidad de pasar por alto pasos cruciales del procesamiento de imágenes. Específicamente, el protocolo enfatiza la eliminación de las variaciones subjetivas asociadas con la operación manual de COMSTAT, incluida la segmentación de imágenes y la selección de funciones de análisis cuantitativo apropiadas. Aunque este método requiere que los usuarios dediquen tiempo adicional a procesar imágenes confocales antes de ejecutar COMSTAT, ayuda a minimizar la heterogenicidad de la biopelícula tergiversada en las salidas automatizadas.

Introducción

Los biofilms son agregados de microorganismos orientados en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) autoproducidas. La matriz de EPS es muy compleja y consta principalmente de células bacterianas, agua, proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos¹, todos los cuales producen biopelículas claramente diferentes de las células planctónicas de vida libre. Los EP de biofilm se adhieren entre sí y a varias superficies. La matriz de EPS tiene propiedades que median el intercambio de metabolitos de célula a célula, material genético y compuestos utilizados para la señalización y defensa intercelular². E....

Protocolo

1. Recolección de aislados bacterianos

1. Obtención de aislados de P. aeruginosa de una cohorte de pacientes pediátricos con FQ en tratamiento de erradicación con tobramicina inhalada en SickKids (Toronto). Congele los aislados a -80 °C en citrato de glicerol y subcultivo al menos tres veces antes de su uso.

2. Formación de biofilm in vitro

NOTA: Utilice un método de cubreobjetos con cámara¹ para la formación de biopelículas in vitro con modificaciones. El flujo de trabajo general de este modelo se muestra en la figura 1

Resultados

Se utiliza un aislado de P. aeruginosa cultivado a partir de un paciente infectado con FQ para demostrar las fortalezas de este enfoque en la cuantificación precisa de los cambios inducidos por los antimicrobianos en la arquitectura de la biopelícula in vitro . El flujo de trabajo general de este modelo se representa en la Figura 1. En la Figura 2 se muestra el procedimiento de procesamiento de imágenes y análisis COMSTAT en ImageJ. En la

Discusión

No existe un método prescrito para comparar cuantitativamente imágenes tridimensionales de estructuras de biopelículas in vitro , y los procedimientos descritos en este contexto son a menudo difíciles de estandarizar debido a la variabilidad entre operadores²⁰. Por lo tanto, este protocolo ofrece un marco simple y reproducible para las aplicaciones de COMSTAT que buscan cuantificar los cambios en la arquitectura de la biopelícula in vitro bajo diversas condiciones antimicrobianas.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-Psl mAb, Psl0096	Medimmune
Blood Agar (TSA con 5 % de sangre de oveja) Medio	Fisher Scientific	R01200
Cubreobjetos de ocho pocillos con pocillos no extraíbles	Thermo Fisher Scientific	155411
Invitrogen SYTO 9 Tinción de ácido nucleico fluorescente verde	Thermo Fisher Scientific	S34854
LB CALDO (LENNOX), Autoclave Líquido Esterilizado	BioShop Canada	LBL666
Tobramicina, 900 µ g/mg	Alfa Aesar de Thermo Fisher Scientific	J66040	Se recomienda realizar una prueba de concentración inhibitoria mínima (MIC) para cada lote fabricado para garantizar el control de calidad de la potencia antimicrobiana
Quorum Volocity 6.3	Quorum Technologies		Software de análisis de imágenes