El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.
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Artículo de método
Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados
En este artículo
Resumen
Resumen
El éxito de implantar tejido cultivado en laboratorio o un dispositivo médico en un individuo está sujeto a la respuesta inmunitaria del huésped receptor. Al considerar un implante como un cuerpo extraño, una respuesta inmune hostil y desregulada puede resultar en el rechazo del implante, mientras que una respuesta regulada y la recuperación de la homeostasis pueden conducir a su aceptación. El análisis de los microambientes de los implantes diseccionados en entornos in vivo o ex vivo puede ayudar a comprender el patrón de la respuesta inmunitaria, lo que en última instancia puede ayudar a desarrollar nuevas generaciones de biomateriales. La citometría de flujo es una técnica bien conocida para caracterizar las células inmunitarias y sus subconjuntos en función de sus marcadores de superficie celular. Esta revisión describe un protocolo basado en el corte manual en cubitos, la digestión enzimática y la filtración a través de un filtro celular para el aislamiento de suspensiones celulares uniformes del tejido del implante disecado. Además, se ha explicado un protocolo de tinción por citometría de flujo multicolor, junto con los pasos para la configuración inicial del citómetro para caracterizar y cuantificar estas células aisladas mediante citometría de flujo.
Introducción
Los avances en el campo de la medicina han llevado al uso frecuente de materiales implantados para apoyar la función o el recrecimiento del tejido dañado 1,2. Estos incluyen dispositivos como marcapasos, implantes cosméticos reconstructivos y placas ortopédicas utilizadas para la fijación de fracturas óseas 3,4. Sin embargo, los materiales utilizados para fabricar estos implantes y los lugares en los que se implantan juegan un papel importante en la determinación del éxito de estos implantes 5,6,7
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Protocolo
NOTA: La Figura 1 ofrece una descripción general del protocolo de citometría de flujo.
1) Preparación de reactivos
- Preparar medios para diluir enzimas y para el cultivo de tejidos.
- Agregue 5 ml de solución tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) en 500 ml de medio RPMI y agite bien. Conservar el medio a 4 °C hasta su posterior uso.
- Calcule el volumen de la solución enzimática.
NOTA: El volumen de la solución enzimática es el volumen del medio que contiene las enzimas (colagenasa y DNasa I) que se necesitarán para digerir el tejido cortado en....
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Resultados
El proceso de desarrollo de paneles de citometría de flujo para el análisis inmunológico a menudo se basa en la comparación de los resultados con los datos existentes y la literatura en el campo. El conocimiento de cómo pueden presentarse las poblaciones en la citometría de flujo es fundamental para la interpretación adecuada de los datos. En cualquier caso, las poblaciones y los tipos de células pueden aparecer de forma diferente en los distintos tejidos, por lo que es de esperar cierta .......
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Discusión
Esta revisión describe una metodología detallada para aislar células de implantes de biomateriales para obtener una suspensión celular uniforme. Además, se ha proporcionado un protocolo detallado para teñir la suspensión celular para la citometría de flujo multicolor, junto con los pasos para configurar un citómetro de flujo para obtener resultados óptimos. Los métodos de aislamiento celular pueden implicar varios pasos, a menudo utilizando la disección manual de tejidos seguida de la digestión enzimática con enzimas pro.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, incluido el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería. Descargo de responsabilidad: Los NIH, sus funcionarios y empleados no recomiendan ni respaldan ninguna empresa, producto o servicio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos cónicos de 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Placa de 6 pocillos | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | Solo para fijar células |
| Albúmina sérica bovina | Millipore Sigma | A7906 | Para la preparación de FACS tampón de tinción |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clon: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clon: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clon: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clon: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clon: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clon: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 Clon: GL1 | |
| CD8a BV421 Biolegend | 100737 | Clon: 53-6.7 | |
| Comp Bead anti-ratón | BD Biosciences | 552843 | Para el control de la compensación |
| DNasa I | Millipore Sigma | 11284932001 | Desoxirribonucleasa I pancreática bovina (DNasa I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | clon: BM8 |
| fc Block | Biolegend | 101301 | clon: 93 |
| Kit de solución de fijación/permeabilización | BD Biosciences | 554714 | Para la fijación y permeabilización de células. |
| Tampón HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer para complementar los medios celulares |
| Liberase | Millipore Sigma 5401127001 | Mezcla de colagenasa I y colagenasa II | |
| LIVE/DEAD kit de tinción de células muertas azules fijables | Thermo Fisher | L23105 | Tinte de viabilidad |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clon: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clon: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 Clon: M5/114.15.2 | |
| Tampón de fosfato salino | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Medios de cultivo celular |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clon: E50-2440 |
| Placa | de 96 pocillos con fondo en V |
Referencias
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.
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Reimpresiones y permisos
