Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

Summary

El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.

Abstract

El éxito de implantar tejido cultivado en laboratorio o un dispositivo médico en un individuo está sujeto a la respuesta inmunitaria del huésped receptor. Al considerar un implante como un cuerpo extraño, una respuesta inmune hostil y desregulada puede resultar en el rechazo del implante, mientras que una respuesta regulada y la recuperación de la homeostasis pueden conducir a su aceptación. El análisis de los microambientes de los implantes diseccionados en entornos in vivo o ex vivo puede ayudar a comprender el patrón de la respuesta inmunitaria, lo que en última instancia puede ayudar a desarrollar nuevas generaciones de biomateriales. La citometría de flujo es una técnica bien conocida para caracterizar las células inmunitarias y sus subconjuntos en función de sus marcadores de superficie celular. Esta revisión describe un protocolo basado en el corte manual en cubitos, la digestión enzimática y la filtración a través de un filtro celular para el aislamiento de suspensiones celulares uniformes del tejido del implante disecado. Además, se ha explicado un protocolo de tinción por citometría de flujo multicolor, junto con los pasos para la configuración inicial del citómetro para caracterizar y cuantificar estas células aisladas mediante citometría de flujo.

Introduction

Los avances en el campo de la medicina han llevado al uso frecuente de materiales implantados para apoyar la función o el recrecimiento del tejido dañado ^1,2. Estos incluyen dispositivos como marcapasos, implantes cosméticos reconstructivos y placas ortopédicas utilizadas para la fijación de fracturas óseas ^3,4. Sin embargo, los materiales utilizados para fabricar estos implantes y los lugares en los que se implantan juegan un papel importante en la determinación del éxito de estos implantes ^5,6,7

Protocol

NOTA: La Figura 1 ofrece una descripción general del protocolo de citometría de flujo.

1) Preparación de reactivos

1. Preparar medios para diluir enzimas y para el cultivo de tejidos.
   1. Agregue 5 ml de solución tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) en 500 ml de medio RPMI y agite bien. Conservar el medio a 4 °C hasta su posterior uso.
2. Calcule el volumen de la solución enzimática.
   NOTA: El volumen de la solución enzimática es el volumen del medio que contiene las enzimas (colagenasa y DNasa I) que se necesitarán para digerir el tejido cortado en....

Results

El proceso de desarrollo de paneles de citometría de flujo para el análisis inmunológico a menudo se basa en la comparación de los resultados con los datos existentes y la literatura en el campo. El conocimiento de cómo pueden presentarse las poblaciones en la citometría de flujo es fundamental para la interpretación adecuada de los datos. En cualquier caso, las poblaciones y los tipos de células pueden aparecer de forma diferente en los distintos tejidos, por lo que es de esperar cierta .......

Discussion

Esta revisión describe una metodología detallada para aislar células de implantes de biomateriales para obtener una suspensión celular uniforme. Además, se ha proporcionado un protocolo detallado para teñir la suspensión celular para la citometría de flujo multicolor, junto con los pasos para configurar un citómetro de flujo para obtener resultados óptimos. Los métodos de aislamiento celular pueden implicar varios pasos, a menudo utilizando la disección manual de tejidos seguida de la digestión enzimática con enzimas pro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos cónicos de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Placa de 6 pocillos	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	Solo para fijar células
Albúmina sérica bovina	Millipore Sigma	A7906	Para la preparación de FACS tampón de tinción
CD11b AF700	Biolegend	101222	Clon: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Clon: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Clon: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Clon: Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Clon: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Clon: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences		564199 Clon: GL1
CD8a BV421 Biolegend		100737	Clon: 53-6.7
Comp Bead anti-ratón	BD Biosciences	552843	Para el control de la compensación
DNasa I	Millipore Sigma	11284932001	Desoxirribonucleasa I pancreática bovina (DNasa I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	clon: BM8
fc Block	Biolegend	101301	clon: 93
Kit de solución de fijación/permeabilización	BD Biosciences	554714	Para la fijación y permeabilización de células.
Tampón HEPES	Thermo Fisher	15630080	Buffer para complementar los medios celulares
Liberase	Millipore Sigma 5401127001		Mezcla de colagenasa I y colagenasa II
LIVE/DEAD kit de tinción de células muertas azules fijables	Thermo Fisher	L23105	Tinte de viabilidad
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Clon: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Clon: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences		742894 Clon: M5/114.15.2
Tampón de fosfato salino	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Medios de cultivo celular
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Clon: E50-2440
Placa			de 96 pocillos con fondo en V