Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

Los avances en el campo de la medicina han llevado al uso frecuente de materiales implantados para apoyar la función o el recrecimiento del tejido dañado ^1,2. Estos incluyen dispositivos como marcapasos, implantes cosméticos reconstructivos y placas ortopédicas utilizadas para la fijación de fracturas óseas ^3,4. Sin embargo, los materiales utilizados para fabricar estos implantes y los lugares en los que se implantan juegan un papel importante en la determinación del éxito de estos implantes ^5,6,7. Como cuerpos extraños, estos implantes pueden generar una respuesta inmune del huésped que puede conducir al rechazo o a la tolerancia⁸. Este factor ha impulsado la investigación de biomateriales para generar materiales que puedan atraer la respuesta inmune deseada después de la implantación 9,10,11,12.

La respuesta inmune es un requisito esencial en el campo de la medicina regenerativa, donde se cultiva un tejido u órgano alrededor de un esqueleto de biomaterial (andamio) en un laboratorio para el reemplazo de un tejido u órgano dañado^13,14,15,16. En medicina regenerativa, el objetivo es reemplazar el tejido faltante o dañado mediante el uso de células, señales y andamios, cada uno de los cuales puede ser modulado en gran medida por las respuestas inmunitarias¹⁷. Además, incluso cuando se desea una falta de respuesta inmunitaria, es muy raro que lo que se desee sea una ausencia de actividad inmunitaria en lugar de la presencia de un perfil regulador¹⁸. Técnicas como la citometría de flujo pueden desempeñar un papel importante en la caracterización del patrón de respuesta inmunitaria a diversos biomateriales utilizados para el recubrimiento de dispositivos de implantes o para el desarrollo de andamios para la ingeniería de tejidos¹⁹.

Esta información, a su vez, ayudará en última instancia en el desarrollo de biomateriales para implantes que puedan ser bien tolerados por el sistema inmunitario o en el desarrollo de andamios que puedan desempeñar un papel constructivo en la ingeniería de tejidos. La preparación adecuada de las muestras para su análisis por citometría de flujo es un paso importante para evitar resultados inexactos en la caracterización inmune mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia^20,21. Por lo tanto, esta revisión presenta una metodología detallada que se puede utilizar para el aislamiento de células del tejido de andamio, la tinción de la suspensión celular y el análisis por citometría de flujo.

NOTA: La Figura 1 ofrece una descripción general del protocolo de citometría de flujo.

1) Preparación de reactivos

1. Preparar medios para diluir enzimas y para el cultivo de tejidos.
   1. Agregue 5 ml de solución tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) en 500 ml de medio RPMI y agite bien. Conservar el medio a 4 °C hasta su posterior uso.
2. Calcule el volumen de la solución enzimática.
   NOTA: El volumen de la solución enzimática es el volumen del medio que contiene las enzimas (colagenasa y DNasa I) que se necesitarán para digerir el tejido cortado en cubitos en placas de 6 pocillos; Depende del número de muestras.
   1. Utilice la siguiente ecuación para calcular el volumen necesario:
      (Número de muestras a digerir) × 5 mL de RPMI sin suero con tampón HEPES de 10 mM
      NOTA: Por ejemplo, para 0,1 a 0,3 g de bazo disecado, use 5 ml de medio para preparar la solución enzimática. El protocolo de digestión enzimática descrito en este manuscrito es principalmente para tejidos blandos (que van de 0,1 a 1 g) disecados de ratones que incluyen el cerebro, el riñón, la piel, el hígado, los pulmones, el bazo, los músculos, así como cápsulas alrededor de implantes subcutáneos hechos de materiales sintéticos o proteínas de la matriz extracelular. La digestión de tejidos cartilaginosos duros puede requerir diferentes condiciones y volúmenes de enzimas digestivas, que solo se pueden determinar mediante optimización.
   2. Calcular la cantidad de colagenasa y DNasa que necesitaba para la solución enzimática.
      NOTA: En este protocolo se utilizaron 0,25 mg/mL de colagenasa y 0,2 mg/mL de DNasa I. Las concentraciones de trabajo requeridas para la colagenasa y la DNasa pueden variar para diferentes tipos de tejidos¹⁹.
3. Prepare una solución de colorante de viabilidad 1:1000 agregando 1 μL del colorante de viabilidad (consulte la Tabla de materiales) a 999 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y agite la solución. Conservar la solución en la oscuridad a 4 °C hasta su nuevo uso.
4. Prepare el tampón de tinción añadiendo 1 g de albúmina sérica bovina (BSA) a 100 ml de PBS, y agite la solución hasta que BSA se disuelva por completo. Conservar la solución a 4 °C hasta su posterior uso.

2) Instalación de placas de digestión enzimática

1. Coloque una placa de 6 pocillos con filtros de células de 70 μm en cada pocillo. Agregue 3 ml del medio preparado del paso 1.1.1 en cada pocillo e incube en hielo.
2. Almacenar el medio restante (2 ml/pocillo) en una incubadora o baño de agua a 37 °C para suspender la cantidad calculada de colagenasa y DNasa I (paso 1.2.2).

3) Aislamiento de células

1. Coloque los implantes/tejido diseccionado en platos y córtelos finamente con unas tijeras. Alternativamente, utilice un método de disrupción mecánica utilizando un disociador de tejidos o un homogeneizador manual. Debido a la gran cantidad de leucocitos, diseccione el bazo para utilizarlo como control de tinción en cada corrida.
   NOTA: Como algunos materiales inducen niveles más altos de fibrosis, este protocolo es aplicable tanto para materiales altamente fibróticos como mínimamente fibróticos. Sin embargo, cada método de procesamiento debe evaluarse tanto para el rendimiento celular como para la viabilidad después de la digestión antes de la tinción. Evite la contaminación de la sangre periférica durante la disección.
2. Añadir colagenasa y DNasa I (volumen calculado en el paso 1.2.2) al RPMI restante (2 ml) que se ha calentado a 37 °C. Agregue 2 ml de la solución enzimática completa a cada pocillo.
3. Coloque las placas en un agitador incubado durante 45 min a 37 °C y 100 rpm.
   NOTA: Tenga cuidado al apilar placas, ya que esto puede inhibir la transferencia de calor adecuada.
4. Mientras tanto, prepare una punta dispensadora de suspensión cortando 3-4 mm del extremo de una punta de 1000 μL con unas tijeras. Después de la incubación, pipetear la suspensión en los pocillos hacia arriba y hacia abajo para mezclarla bien con la punta picada. Coloque el filtro de células en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y pase la solución digerida a través del filtro de células.
   NOTA: El filtro celular de 70 μm es suficiente para separar las células del biomaterial implantado, como el alginato. Si se requiere una mayor pureza, se utilizan procesos como la separación por gradiente de densidad para obtener una población enriquecida de leucocitos.
5. Enjuague los pocillos con 1 solución de PBS y transfiera el volumen de enjuague a través del colador, luego agregue los lavados del colador con 1 solución de PBS hasta que el volumen en el tubo alcance los 50 ml.
   NOTA: El PBS 1x debe estar a temperatura ambiente para evitar cualquier aumento en la viscosidad del digesto y para permitir la granulación celular durante la centrifugación.
6. Centrifugar el tubo a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante con cuidado con una pipeta serológica sin alterar el gránulo. Vuelva a suspender el gránulo en 1000 μL de 1x PBS y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga.
7. Mezcle 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripano, y cargue la suspensión en portaobjetos de la cámara de recuento para contar células utilizando un contador automático de células o en un hemocitómetro para contar mediante el método convencional bajo un microscopio. Alternativamente, use perlas de recuento de células por citometría de flujo.

4) Tinción para citometría de flujo

1. Consulte la Figura 2 para ver un ejemplo de diseño de placa para un experimento de 14 colores con 45 muestras, controles de fluorescencia menos uno (FMO), controles de compensación y un control de muestra de bazo completamente teñido. Después de estimar el número total de células, calcule el volumen de la suspensión celular necesario para la tinción de 1 × 10 6 células para cada muestra, y 0,5 × 10⁶ células para cada compensación y control de FMO. Dispense el volumen requerido de la suspensión celular en los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en V y compense el volumen a 100 μL con 1x PBS.
   NOTA: A modo de ejemplo, si 1000 μL de suspensión celular obtenidos en el paso 3.6 contienen 40 × 10⁶ células, entonces para 1 × 10 6 células, se necesitarán 1000/40 × 10⁶ = 25 μL de suspensión celular.
2. Centrifugar la placa a 300 × g durante 5 min a 4 °C, aspirar el sobrenadante y luego resuspender las células en los pocillos de muestra y en un pocillo de control de compensación para determinar la viabilidad, con 100 μL de una solución 1:1000 del colorante de viabilidad (ver Tabla de Materiales).
3. En el caso de las células de los otros pocillos de compensación, así como de los pocillos FMO y no teñidos, vuelva a suspenderlos con 100 μL de PBS 1x.
4. Incubar las células en la oscuridad durante 30 min a 4 °C.
5. Mientras tanto, prepare un cóctel de anticuerpos de superficie para teñir la muestra y los controles de FMO: 50 μL por muestra o FMO. Consulte la Tabla 1 para ver un ejemplo del cóctel de anticuerpos.
6. Después de la incubación, añadir 100 μl de 1x PBS a cada pocillo, centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
7. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender en 200 μL de tampón de tinción (1x PBS + 1% BSA); centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
8. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en los pocillos de compensación, FMO y no teñidos con 50 μL de PBS 1x. Añadir 50 μL del cóctel de anticuerpos a los pocillos de muestra y pocillos FMO respectivos. Agregue los anticuerpos respectivos a los diferentes pocillos de compensación.
9. Incubar la placa durante 45 min en la oscuridad a 4 °C. Después de la incubación, añadir 150 μL de tampón de tinción en cada pocillo y centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
10. Aspirar el sobrenadante, resuspender las células con 200 μL de tampón de tinción y centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
11. Si se analizan muestras sin fijación, vuelva a suspenderlas en 200 μL de tampón de tinción y continúe con la sección 6 sobre configuración del citómetro y análisis de muestras. Si se fijan las células, aspire el sobrenadante después del lavado y agregue 100 μL de un fijador como paraformaldehído al 4%. Si se trata de tinción para marcadores intracelulares, se procede a la sección 5 sobre tinción intracelular, y se fijan y permeabilizan las células (ver Tabla de materiales). Incubar las células durante 20 min en la oscuridad a 4 °C.
    NOTA: Como la fijación puede afectar la intensidad de fluorescencia de algunos fluoróforos, evalúe cada panel con y sin fijación.
12. Después de la incubación, añadir 100 μL de 1x PBS, seguido de centrifugación a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante, resuspender en 1x PBS y centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
13. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de tinción y guárdelas a 4 °C antes del análisis citométrico de flujo.

5) Tinción intracelular

1. Continuando desde el paso 4.11 para la fijación y permeabilización de los marcadores intracelulares, añadir 100 μL del tampón adecuado. Centrifugar las células a 350 × g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender los gránulos en 200 μL de la solución de agente fijador-permeabilizante; centrifugar las células a 350 × g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos con anticuerpos intracelulares diluidos en el tampón adecuado.
   NOTA: Los tipos de anticuerpos y las diluciones dependerán de las células diana. Por ejemplo, un marcador intracelular común es la caja de cabeza de horquilla P3 para las células T reguladoras, que se usa con frecuencia en una dilución de 1:100.
2. Incubar la suspensión celular en la oscuridad durante 45 min a 4 °C. Después de la incubación, añadir 150 μL del tampón adecuado y centrifugar la suspensión a 350 × g durante 5 min a 4 °C.
3. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 200 μL de tampón de tinción, seguido de centrifugación a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Aspirar y volver a suspender las células en 200 μL de tampón de tinción para el análisis citométrico de flujo.

6) Configuración del citómetro y la compensación

1. Inmediatamente antes de ejecutar las muestras, prepare perlas de compensación (consulte la Tabla de materiales) si utiliza la compensación basada en perlas en lugar de la compensación basada en celdas.
   1. Etiquete los tubos de microcentrífuga separados para cada anticuerpo conjugado con fluorocromo y agregue 100 μL de 1x PBS seguido de una gota completa de perlas de compensación de control negativo anti-ratón y una gota de perlas de compensación de control positivo a cada tubo. Agregue 1 μL del anticuerpo apropiado a cada tubo por separado. Vórtice e incube durante 5 minutos antes de la adquisición.
      NOTA: Como algunos tintes, como BUV737, no se pueden unir a las perlas, utilice un control basado en células.
2. Calibre el citómetro de flujo antes de cada experimento ejecutando la configuración del citómetro con las perlas de seguimiento y mantenga la configuración del citómetro de flujo para cada experimento.
3. Antes de analizar la muestra, ajuste el citómetro de flujo ejecutando una muestra sin tinción para ajustar la población de células en un diagrama de dispersión lateral (SSC) frente a dispersión directa (FSC) para que la población de células caiga en el centro del diagrama y no esté fuera de escala.
4. Ejecute la muestra teñida brevemente para ajustar los voltajes para FSC y SSC y para cada canal para asegurarse de que ningún evento quede fuera de la escala logarítmica de cada canal. Registre 5.000 eventos para cada control de compensación, seguido de la activación de poblaciones positivas y negativas. Calcule la matriz de compensación y luego ejecute las muestras, reuniendo al menos 1.000 eventos para las poblaciones de interés.
   NOTA: Se debe verificar la compensación en paneles de colores más grandes, ya que la compensación automatizada puede ser propensa a una compensación excesiva o insuficiente. Cada parámetro debe ser graficado en comparación con todos los demás parámetros para monitorear los signos de sobrecompensación o subcompensación, y cada control de un solo color debe ser evaluado. La compensación compleja de experimentos de mayor color debe llevarse a cabo con la ayuda de un colaborador o de una instalación central con amplia experiencia en citometría de flujo. Los tipos más nuevos de citómetros de flujo, como los citómetros espectrales, utilizan el espectro completo de un fluoróforo a través de un proceso conocido como desmezcla espectral, que puede producir una distinción más clara de la superposición fluorescente en comparación con la compensación estándar sola²².

El proceso de desarrollo de paneles de citometría de flujo para el análisis inmunológico a menudo se basa en la comparación de los resultados con los datos existentes y la literatura en el campo. El conocimiento de cómo pueden presentarse las poblaciones en la citometría de flujo es fundamental para la interpretación adecuada de los datos. En cualquier caso, las poblaciones y los tipos de células pueden aparecer de forma diferente en los distintos tejidos, por lo que es de esperar cierta variabilidad. En el contexto de tejidos de control bien definidos, dicha optimización de la tinción se puede evaluar en comparación con tejidos conocidos que tienen tipos de células bien investigados. La Figura 3 muestra los resultados de un FACS de 14 colores en tejido de ratón de control. En este caso, se utilizó el bazo para identificar todos los marcadores que se tiñeron y para demostrar que la tinción era técnicamente funcional. A partir de este momento, se hizo más fácil realizar pruebas en condiciones desconocidas, confiar en la selección de fluoróforos y optimizar el protocolo para diferentes fuentes de tejidos. La Figura 3 también muestra poblaciones de diferentes tipos celulares aisladas de un bazo murino19.

Aquí, se pudieron observar varias poblaciones obvias, como los neutrófilos Ly6G+, y diferentes niveles de expresión de Ly6C en diferentes clases de monocitos. Las células dendríticas CD11chiMHCII+ fueron evidentes cuando se comprimieron contra CD11b para descartar macrófagos y otras células de linaje mieloide como neutrófilos y monocitos. Se pudo encontrar un subconjunto de células dendríticas CD206+CD86+ centrándose en esta población CD11c+. CD86 y CD206 se incluyeron en el fenotipo de las células mieloides como si estuvieran en un estado de polarización más similar a M1 (CD86hi) frente a un estado de polarización más similar a M2 (CD206hi). F4/80 mostró un gradiente de expresión, que se puede observar comúnmente en varias poblaciones de macrófagos. Siglec-F estuvo presente en dos poblaciones, F4/80+ y F4/80-, muy probablemente correspondiendo a un subconjunto de macrófagos y eosinófilos, respectivamente. Aunque se pueden hacer estas designaciones de tipos de células, es importante tener en cuenta que las células que expresan diferentes marcadores deben verse de una manera funcional en lugar de una clasificación más binaria. El reconocimiento de que lo que se considera un macrófago puede diferir en el bazo y en la cápsula de cuerpo extraño alrededor de un implante, es importante y evita la posible interpretación errónea de los resultados.

Figura 1: Descripción general del protocolo de tinción por citometría de flujo. La preparación incluye la disección del tejido de interés seguida de 1) corte manual en cubitos, 2) digestión enzimática, 3) colado y lavado celular, y 4) tinción con anticuerpos marcados con fluorescencia seguidos de un análisis citométrico de flujo. La ilustración fue realizada con Biorender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplo de un diseño de placa para tinción por citometría de flujo. Este diseño incluye las muestras, los controles de fluorescencia menos uno (FMO), los controles de compensación y una muestra de tejido de control (bazo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados representativos de la tinción de FACS de 14 colores en tejido de ratón de control. Fenotipado de células mieloides de células murinos del bazo con ejemplos de compuerta manual y algoritmo automatizado de agrupación en clústeres de vecinos t-estocásticos (t-SNE) para la visualización de datos. Esta figura ha sido reproducida de Sadtler y Elisseeff19. Abreviaturas: FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; SSC = dispersión lateral; CD = conglomerado de diferenciación; PE = ficoeritrina; CCR = tipo de receptor de quimiocinas C-C; MHC = complejo mayor de histocompatibilidad; PerCP = complejo proteico de peridinana clorofila. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Ejemplo de cóctel de anticuerpos de superficie. Un ejemplo de cóctel de anticuerpos para el fenotipado mieloide del tejido de ratón.

Los autores no tienen nada que revelar.