Un pequeño ARN no codificante MicC contribuye a la virulencia en las proteínas de la membrana externa en Salmonella enteritidis

Resumen

Se utilizó un sistema de recombinación mediado por λ-Red para crear un mutante de deleción de un pequeño micC de ARN no codificante.

Resumen

Un ARN pequeño no codificante (ARNs) es un nuevo factor para regular la expresión génica a nivel post-transcripcional. Un tipo de sRNA MicC, conocido en Escherichia coli y Salmonella Typhimurium, podría reprimir la expresión de proteínas de la membrana externa. Para investigar más a fondo la función de regulación de micC en Salmonella Enteritidis, clonamos el gen micC en la cepa 50336 de Salmonella Enteritidis, y luego construimos el mutante 50336Δ micC mediante el sistema de recombinación λ de base roja y el mutante complementario 50336Δ micC/p micC portador del plásmido recombinante pBR322 que expresa micC. Los resultados de qRT-PCR demostraron que la transcripción de ompD en 50336Δ micC fue 1,3 veces mayor que en la cepa de tipo salvaje, mientras que la transcripción de ompA y ompC en 50336Δ micC fue 2,2 veces mayor y 3 veces mayor que la de la cepa de tipo salvaje. Estos indicaron que micC reprime la expresión de ompA y ompC. En el siguiente estudio, la patogenicidad de 50336ΔmicC se detectó infectando ratones Balb/c de 6 semanas de edad y pollos de 1 día de edad. El resultado mostró que la LD 50 de la cepa de tipo salvaje 50336, los mutantes 50336Δ micC y 50336Δ micC / p micC para ratones Balb / c de 6 semanas de edad fueron 12.59 UFC, 5.01 UFC y 19.95 UFC, respectivamente. Las DL 50 de las cepas para pollos de 1 día de edad fueron 1.13 x 10⁹ UFC, 1.55 x 10 8 UFC y_{2.54 x 10} ⁸ UFC, respectivamente. Indicó que la eliminación de micC aumentaba la virulencia de S. Enteritidis en ratones y pollos mediante la regulación de la expresión de proteínas de la membrana externa.

Introducción

Los ARN pequeños no codificantes (ARNs) tienen una longitud de 40-400 nucleótidos, que generalmente no codifican proteínas, pero podrían transcribirse independientemente en cromosomas bacterianos ^1,2,3. La mayoría de los ARNs están codificados en las regiones intergénicas (IGR) entre las regiones codificantes de genes e interactúan con los ARNm diana a través de acciones de apareamiento de bases, y regulan la expresión de genes diana a nivel post-transcripcional ^4,5. Desempeñan importantes funciones de regulación en e....

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. El comité de cuidado y uso de animales de la Universidad de Yangzhou aprobó todos los experimentos y procedimientos aplicados a los animales (SYXK2016-0020).

1. Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo

1. Utilice las bacterias y plásmidos enumerados en la Tabla 1.
2. Cultivar bacterias en caldo LB o en placas de agar LB a 37 °C, en presencia de 50 μg/ml de ampicilina (Amp) cuando proceda.
3. Las cepas de cultivo que contienen plásmidos sensibles....

Resultados

Construcción del mutante 50336Δ micC y cepa complementada 50336Δ micC /p micC
El resultado del clon del gen micC indicó que este gen estaba compuesto por 109 pb mostrando una identidad del 100% con la de S. Typhimurium. Con base en los datos de secuencia, el mutante de deleción 50336ΔmicC y el mutante complementario 50336ΔmicC/pmicC

Discusión

S. La enteritidis es un importante patógeno intracelular facultativo que puede infectar pollos jóvenes y produce síntomas desde enteritis hasta infección sistémica y muerte^17,18. Además, S. enteritidis causa infecciones latentes en pollos adultos y los portadores crónicos contaminan los productos avícolas, lo que resulta en infecciones transmitidas por los alimentos en humanos¹⁹. El mecanismo patogénico de S. ent.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
dextrosa	Sangon Biotech	A610219	para la preparación de caldos
kit de purificación de ADN	TIANGEN	DP214	para la purificación de ADN
Ex Taq	TaKaRa	RR01A	PCR
KH2PO4	Sinopharm Reactivo Químico	10017608	para la preparación de caldos
K2HPO4	Sinopharm Reactivo Químico	20032116	para la preparación de caldos
L-Arabinose	Sangon Biotech	A610071	λ-Red recombinación
de rojo Mini Kit de plásmido	TIANGEN	DP106	extracción de plásmidos
NaCl	Sinopharm Reactivo Químico	10019308	para la preparación
de caldos(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	para la preparación de caldos
PrimeScriptRRT Kit de reactivos con borrador de ADNg	TaKaRa	RR047	qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II	TaKaRa	RR820	qRT-PCR
T4 ADN Ligasa	NEB	M0202	Ligadura
TRIzol	Invitrogen	15596018	aislamiento de ARN
Triptona	Oxoid	LP0042	para la preparación de caldo
Extracto de levadura	Oxoid	LP0021	para la preparación de caldo
centrífuga	Eppendorf	5418	centrifugación
Aparato de electroforesis	Bio-Rad	164-5050	Electroforesis
Sistema de electroporación	Bio-Rad	165-2100	para la transformación bacteriana
Espectrofotómetro	BioTek	Epoch	Detección de absorbancia
Sistema de PCR en tiempo real	Sistema Applied Biosystems	7500	qRT-PCR