Artículo de método

Expresión heteróloga y análisis funcional de los receptores odorantes de Aedes aegypti a olores humanos en ovocitos de Xenopus

DOI:

10.3791/61813

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8 de junio de 2021

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1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, 2Departments of Biochemistry & Biophysics, and Cellular & Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se presenta un protocolo que caracteriza funcionalmente los quirófanos de mosquitos en respuesta a los olores humanos utilizando un sistema de expresión de ovocitos de Xenopus junto con una pinza de voltaje de dos electrodos, proporcionando una nueva y poderosa técnica para explorar las respuestas de los quirófanos de mosquitos a la exposición a los olores humanos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), vector de muchas enfermedades humanas importantes, como la fiebre amarilla, el dengue y la fiebre del Zika, muestra una fuerte preferencia por los huéspedes humanos sobre otros animales de sangre caliente para alimentarse de sangre. Las señales olfativas juegan un papel fundamental para los mosquitos a medida que exploran su entorno y buscan un huésped humano para alimentarse de sangre, transmitiendo así enfermedades humanas. Se sabe que los receptores odorantes (OR) expresados en las neuronas sensoriales olfativas son responsables de la interacción de los mosquitos vectores con los olores humanos. Para obtener una visión más profunda de la fisiología olfativa de Ae. aegypti e investigar sus interacciones con los humanos a nivel molecular, utilizamos un protocolo optimizado de expresión heteróloga de ovocitos Xenopus para analizar funcionalmente los receptores odorantes de Ae. aegypti en respuesta a olores humanos. Se presentan tres ejemplos de experimentos: 1) Clonación y síntesis de ARNc de ORs y correceptores de receptores odorantes (Orco) de cuatro a seis días de edad de antenas de Ae. aegypti ; 2) Microinyección y expresión de ORs y Orco en ovocitos de Xenopus ; y 3) Registro de corriente de célula completa de ovocitos de Xenopus que expresan ORs de mosquitos/Orco con una pinza de voltaje de dos electrodos. Estos procedimientos optimizados proporcionan una nueva forma para que los investigadores investiguen la recepción de olores humanos en los mosquitos Aedes y revelen los mecanismos subyacentes que gobiernan su actividad de búsqueda de huéspedes a nivel molecular.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El mosquito de la fiebre amarilla Ae. aegypti puede transmitir muchas enfermedades mortales, como la fiebre amarilla, el dengue y la fiebre del Zika, causando una enorme angustia y la pérdida de vidas. Los mosquitos hacen uso de múltiples señales, como elCO2, el olor de la piel y el calor corporal, para localizar asus huéspedes. Dado que tanto los humanos como otros animales de sangre caliente producenCO2 y tienen temperaturas corporales similares, parece probable que las hembras de Ae. aegypti dependan principalmente del olor de la piel para discriminar al huésped2. Sin embargo, esto crea un panorama complejo, con un estudio temprano que aísla más de 300 compuestos de las emanaciones de la piel humana. Otros ensayos conductuales han indicado que varios de estos compuestos evocan respuestas conductuales en Ae. aegypti 4,5,6,7, pero la forma exacta en que el mosquito detecta estos compuestos sigue siendo en gran medida desconocida. Investigaciones recientes de nuestro grupo han identificado varios odorantes humanos que pueden estar involucrados en la actividad de búsqueda de huéspedes de Ae. aegypti, aunque sus funciones aún no han sido confirmadas por ensayos de comportamiento adicionales8. Todavía no se ha establecido cómo se decodifican estos odorantes humanos esenciales en el sistema sensorial periférico de Ae. aegypti.

Los insectos detectan los olores a través de la sensibilidad quimiosensorial de sus apéndices olfativos. Dentro de cada una de las sensillas, se expresan diferentes receptores olfativos, incluyendo receptores odorantes (ORs), receptores ionotrópicos (IRs) y receptores gustativos (GRs), en la membrana de las neuronas sensoriales olfativas9. Estos quirófanos son responsables de detectar muchos odorantes encontrados por los insectos, especialmente los olores asociados con la comida, los huéspedes y los compañeros de apareamiento 10,11,12,13. Un estudio previo centrado en la desorfanización de la función de los OR en Anopheles gambiae utilizando el sistema de expresión de Xenopus junto con una pinza de voltaje de dos electrodos ha encontrado que los OR de Anopheles están específicamente sintonizados con los aromáticos que son los componentes principales en las emanaciones humanas14. Un estudio reciente del genoma identificó hasta 117 genes OR en Ae. aegypti15. En consecuencia, una forma de abordar sistemáticamente las funciones de estos OR de Aedes en respuesta a odorantes biológica o ecológicamente importantes, como los olores humanos o los estímulos de oviposición, proporcionaría información útil para aquellos que buscan comprender mejor la ecología química o la neuroetología de Ae. aegypti.

La técnica de pinza de voltaje de dos electrodos (TEVC) se desarrolló originalmente para examinar la función de los canales iónicos de membrana a mediados de la década de 199016,17. Desde entonces, TEVC se ha utilizado para investigar OR de varias especies de insectos diferentes 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Este examen funcional de los quirófanos ha contribuido sustancialmente a responder a importantes preguntas ecológicas en los insectos, entre ellas: 1) ¿Cómo localizan los insectos las fuentes de alimento? 2) ¿Cómo se sienten atraídos por las feromonas sexuales volátiles liberadas por sus parejas de apareamiento? 3) ¿Cómo encuentran un sitio de oviposición perfecto para su descendencia? y 4) ¿Existen compuestos, derivados de plantas o sintéticos, que puedan proteger eficazmente a los humanos de las picaduras de insectos? Las respuestas a estas preguntas son cruciales para controlar importantes vectores de enfermedades, como los mosquitos.

En los estudios funcionales de quirófano también se han utilizado otros enfoques, incluidos los basados en la línea celular de riñón embrionario humano 293 (HEK293), el sistema de neuronas vacías de Drosophila, la nucleasa de dedos de zinc, la nucleasa efectora similar a un activador de transcripción y el sistema de edición génica CRISPR/Cas9 12,20,35,36,37. Sin embargo, todas estas técnicas requieren las habilidades de un biólogo molecular experimentado e involucran múltiples factores potencialmente confusos. La expresión de TEVC/ovocitos es capaz de medir directamente las corrientes de los receptores evocados por el olor y la conductancia iónica y tiene la ventaja añadida del rápido tiempo de configuración necesario para expresar los receptores del ARNc. Por lo tanto, en este estudio, utilizamos TEVC para examinar las respuestas de un Ae. aegypti OR55 (AaegOR55) frente a varios odorantes con potencial relevancia biológica, revelando que los ovocitos expresados con AaegOR55•AaegOrco mostraron una respuesta dependiente de la dosis al odorante humano benzaldehído.

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Protocolo

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El protocolo para este procedimiento, el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, está aprobado y monitoreado (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Auburn: protocolo aprobado # 2016-2987).

NOTA: La síntesis de genes personalizados es una alternativa viable a la clonación de genes de mosquitos OR.

1. Colección de mosquitos y apéndices olfativos (antenas)

  1. Mantener los mosquitos Ae. aegypti (obtenidos del Dr. James Becnel, USDA, ARS, Unidad de Investigación de Mosquitos y Moscas) a 25 ± 2°C y un fotoperiodo de 12:12 (L:D) h (luces encendidas a las 8 am).
  2. Anestesiar ~ 800 mosquitos hembra de 4-6 días de edad sin alimentación de sangre usando CO2. Cortar las antenas de los mosquitos (tejidos olfativos) bajo un microscopio (40x) con unas tijeras y recogerlas en un tubo de centrífuga de 1,5 mL mantenido en hielo seco.
    NOTA: Las antenas recogidas pueden almacenarse en un congelador a -80 °C o utilizarse inmediatamente.

2. O Clonación a partir de antenas de Ae. aegypti

  1. Extraiga el ARN total de las antenas utilizando un kit de ARN total disponible en el mercado siguiendo el protocolo del fabricante.
  2. Digiera el ARN total utilizando el kit comercial sin ADN para eliminar la DNasa y otros iones siguiendo el protocolo del fabricante.
  3. Sintetizar ADNc a partir de 1,5 μg de ARN libre de ADN utilizando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript IV preparado con Oligo d(T)2013,30.
  4. Diseñe cebadores de PCR para los genes OR de acuerdo con las secuencias disponibles en VectorBase (https://www.vectorbase.org/) y los requisitos especiales del sitio de corte de la enzima. Agregue una secuencia de Kozak (GCCACC), que inicia la traducción en la mayoría de los organismos eucariotas, entre el sitio de corte y el codón de inicio en cada cebador directo30.
  5. Clone las secuencias codificantes de los genes OR mediante PCR utilizando cebadores específicos de genes que contienen sitios endonucleasa de restricción y la secuencia de Kozak siguiendo el protocolo del fabricante.
  6. Detecte productos de PCR a través de un gel de agarosa al 1% y purifique utilizando un kit de extracción de gel comercial siguiendo el protocolo del fabricante.
  7. Realizar la construcción de plásmidos recombinantes mediante la clonación de productos de PCR en un vector pT7Ts después de la digestión mediante enzimas de restricción siguiendo el protocolo del fabricante.
  8. Verifique los plásmidos recombinantes mediante secuenciación de Sanger y confirme utilizando la base de datos VectorBase.

3. Síntesis de ARNc

  1. Linealizar los plásmidos construidos con enzima(s) de restricción específica(s).
    NOTA: El ADN plasmídico debe ser linealizado con una enzima de restricción aguas abajo del gen que se va a transcribir.
  2. Utilice los plásmidos linealizados para sintetizar ARNc con un kit comercial T7 siguiendo una descripción previa13,30.
  3. Premezcle el ARNc de OR y Orco (1:1) en un tubo de centrífuga y alícuota el ARNc mezclado en un volumen de 2 μL (250 ng/μL/cada uno) para cada tubo de PCR. Almacene el ARNc alícuota a -80 °C antes de usarlo.

4. Colección de ovocitos de Xenopus

NOTA: El procedimiento sigue las instrucciones de Schneider et al.38.

  1. Anestesiar Xenopus laevis durante 20-30 min en 1 L de agua ultrapurificada con 1 g de sal de metanosulfonato de m-aminobenzoato de etilo (Figura 1A). Pellizca uno de los dedos de la rana con los dedos; Si no hay respuesta, la rana está suficientemente anestesiada y lista para la cirugía. Transfiera la rana anestesiada en el lecho de hielo.
  2. La cirugía
    1. Frote el área ventral de la rana con una solución de povidona yodada al 10% y limpie la solución con bolas de algodón limpias. Repita este paso 2 veces.
    2. Realice una pequeña incisión abdominal (10-15 mm, Figura 1B) con un bisturí desechable. Penetra en la piel, la capa de músculo de la fascia por separado. La incisión se realiza en la parte inferior del abdomen, lateral a la línea media.
      NOTA: No lesione los órganos internos.
    3. Agarre partes de los lóbulos ováricos con fórceps y tire hacia el exterior suavemente. Levanta el ovario y córtalo a la altura de la pared del cuerpo con unas tijeras. Repita varias veces hasta obtener suficiente material ovárico (~200 óvulos, Figura 1C). Transfiera los materiales ováricos al tampón de lavado (96 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 5 mM de MgCl2•6H2O, 5 mM de sal de sodio HEPES, 10 μg/mL de gentamicina, pH 7,6).
    4. Cierre las heridas de la cirugía (tanto musculares como cutáneas) con suturas reabsorbibles que normalmente se degradan y caen de forma natural en 10-14 días.
    5. Después de cada cirugía, coloque la rana en 1 litro de solución de recuperación (que contenga 3,4 g de sal para enlatar y encurtir y 2 g de sal marina oceánica instantánea) hasta que se despierte y luego devuélvala a las instalaciones de ranas.
      NOTA: Se pueden realizar hasta 4 cirugías en cada rana. El intervalo de operación de cada rana debe ser de más de 2 meses.
  3. Digestión enzimática desfoliculada y cultivo de ovocitos
    1. Separe los ovocitos (~200 óvulos, Figura 1C) en trozos pequeños.
    2. Transferir todos los ovocitos a una solución de digestión, incluyendo 10 mL de tampón de lavado (Sección 4.2.3) y 2 mg/mL de colagenasa B durante 40-60 min a temperatura ambiente para eliminar las capas de células foliculares. Examinar las muestras bajo un microscopio para determinar si el 80% de los ovocitos han sido completamente desfoliculados; Si no es así, revise cada 10 minutos hasta que la mayoría de los ovocitos estén listos.
    3. Enjuagar los ovocitos con 1x solución de Ringer (96 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 5 mM de MgCl2·6H2O, 5 mM de sal sódica HEPES, pH 7,6), tampón de lavado (sección 4.2.3), solución salina de Barth modificada (78 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,33 mM de Ca(NO3)2·4H2O, 0,41 mM de CaCl2·2H2O, 0,82 mM MgSO 4,7H 2O, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM de sal sódica HEPES, 1,8 mM de piruvato sódico, 10 μg/mL de gentamicina, 10 μg/mL de estreptomicina, pH 7,6) en secuencia (5 veces para cada tampón, utilizando 10 mL cada vez). Enjuagar abundantemente los ovocitos con tampones para eliminar los ovocitos inmaduros y de mala calidad.
    4. Recolectar ovocitos en estadio V-VI según la clasificación de Dumont. Transfiera los ovocitos sanos/de buena calidad en los estadios V-VI con una división blanca clara/oscura y sin daños visualmente evidentes (Figura 1D) a una placa de Petri de 100 mm x 15 mm que contenga solución salina de Barth modificada (Sección 4.3.3). Desechar los ovocitos de mala calidad (Figura 1E). Mantener los ovocitos digeridos en cámaras de crecimiento de insectos a 18 °C durante unas 24 horas antes de la microinyección.

5. Microinyección de ARNc y expresión de receptores odorantes (ORs) y correceptores OR (Orco) en ovocitos de Xenopus

  1. Colocar una matriz metálica en la placa de Petri de 100 mm x 15 mm, añadiendo solución salina de Barth modificada (Sección 4.3.3) hasta sumergir la matriz. Transfiera los ovocitos en la matriz y deseche los ovocitos que no cumplan con el tamaño. Colocar los ovocitos con los polos vegetales en la parte superior (Figura 1F).
  2. Extraiga un capilar de vidrio fresco (1,0 mm de diámetro exterior x 0,5 mm de diámetro interior, longitud = 100 mm) para cada muestra con un extractor de microtubos (calor = 525, tracción = 50, velocidad = 50, tiempo = 250) y afile con una biseladora de micropipeta en un ángulo de 25°. Monte el tubo capilar en el inyector de nanolitros.
  3. Antes de la inyección, retire un tubo de ARNc premezclado de OR y Orco (Sección 3.3) del congelador y colóquelo en hielo hasta que se disuelva por completo. Llene el tubo capilar con la mezcla OR / Orco presionando el botón Llenar del inyector de nanolitros.
  4. Inyecte 10 ng (5 ng O + 5 ng Orco; ~ 20 nL) del ARNc premezclado para cada ovocito con un inyector de nanolitros en una estación libre de ARNasa. (Figura 1F).
    NOTA: Antes de la inyección, presionamos el botón VACÍO para descargar poca mezcla y asegurarnos de que el tubo capilar no esté bloqueado. Esperar unos 5 segundos para que los ARNc entren en el ovocito por completo.
  5. Después de la inyección, almacene los ovocitos en una placa de cultivo celular estéril de 24 pocillos con solución salina de Barth modificada a 18 °C durante 3-7 días antes del registro de células completas.

6. Registro de corriente de celda completa mediante un sistema de pinza de voltaje de dos electrodos (Figura 2)

  1. Antes del registro de pinza de voltaje de dos electrodos, disuelva los compuestos odorantes individuales en dimetilsulfóxido (DMSO) para obtener una serie de soluciones madre (100 μg / μL). Diluir estas soluciones madre con 1x tampón ND96 (91 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2,2H 2O, 2 mM de MgCl 2,6H2O, 5 mM de sal de sodio HEPES, pH 7,6) 1000 veces para obtener un conjunto de soluciones de trabajo (0,1 μg/μL).
  2. Asegúrese de que todo lo que hay en la mesa de aislamiento de vibraciones TMC, incluido el blindaje metálico, el microscopio, la fuente de luz y la bomba de desechos, esté cuidadosamente conectado a tierra para reducir el efecto del ruido eléctrico externo en la grabación de la señal de toda la celda.
  3. Prepare los microelectrodos tirando de un capilar de vidrio (1,20 mm de diámetro exterior x 0,94 mm de diámetro interior, longitud = 750 mm) utilizando un extractor de microtubos (calor = 525, tracción = 50, velocidad = 50, tiempo = 250). Llene los capilares con 3 M de KCl. Clorure los alambres de Ag/AgCl durante 2-5 min en blanqueador con cloro al 10% hasta que adquieran un color gris oscuro (los alambres de Ag/AgCl gris pálido deben clorarse).
  4. Encienda la máquina encendiendo la pinza de ovocitos y el digitalizador de Digidata (Figura 3A). Abra el software (por ejemplo, Clampex 10.3) y haga clic en el botón Grabar . Encienda el interruptor para el 1x tampón ND96 (Sección 6.1) y la bomba para el tampón de desechos.
  5. Realice una prueba previa insertando microelectrodos en el tampón de flujo y luego presionando el botón de prueba de electrodos Vm y el botón de prueba de electrodos Ve para verificar la resistencia de los microelectrodos. Vm debe ser < 40 mV y Ve debe ser < 40 μA. Apague el caudal del tampón ND96 (Sección 6.1) y la bomba de residuos después de la prueba previa.
  6. Coloque cada ovocito en la cámara de perfusión (Figura 2) llena con 1x tampón ND96 (Sección 6.1) y coloque suavemente los ovocitos con los polos vegetales hacia arriba junto a la oruga de vidrio. Inserte los electrodos lentamente en el ovocito (Figura 3B). Ajuste el parámetro Vm a 0 y, a continuación, el parámetro Ve a 0. Cambie el botón de fijación de OFF a FAST. Ajuste el botón de ganancia a ~ -80 mV.
  7. Compruebe el valor de Ve, que debe ser constante. De lo contrario, hay una fuga en al menos uno de los dos microelectrodos. Si esto sucede, reemplace los componentes defectuosos por capilares nuevos.
  8. Registre las corrientes de toda la célula de los ovocitos inyectados con una pinza de ovocitos a un potencial de retención de ~-80 mV (Figura 2).
  9. Realizar la adquisición y el análisis de datos.
    1. Reanude el flujo del tampón 1x ND96 (Sección 6.1) y encienda la bomba de residuos.
    2. Aplicación de la solución odorante a través del sistema de perfusión: apague el tampón ND96 1x (Sección 6.1) y haga fluir la solución odorante durante 10 segundos. A continuación, registre el valor máximo. Para obtener la respuesta del quirófano al odorante de prueba, reste el valor de referencia del valor máximo.
    3. Detenga el flujo de la solución odorante y cambie al tampón ND96 1x (Sección 6.1). Lavar el ovocito con el tampón hasta que el rastro actual se recupere de la estimulación odorífera anterior. A continuación, el ovocito está listo para ser estimulado por otra solución odorante. Generalmente, un ovocito se puede usar para detectar 20-30 estimulaciones químicas.
      NOTA: Al probar la respuesta dependiente de la concentración, siempre se debe aplicar primero la concentración más baja antes de pasar a las concentraciones más altas.

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Resultados

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Utilizando la técnica de registro de sensillum único (SSR), recientemente identificamos odorantes humanos que se cree que son importantes para el comportamiento de búsqueda de huéspedes de Ae. aegypti 8. Sin embargo, el mecanismo molecular que impulsa el proceso de detección de odorantes humanos en el sistema sensorial periférico de Ae. aegypti sigue siendo desconocido. Los OR juegan un papel importante en la detección de ligandos odorantes en la mayoría de los insectos 10,11,12....

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Discusión

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TEVC es una técnica clásica que se usa ampliamente para examinar la función de los receptores de membrana. A pesar de que ya se ha publicado un protocolo detallado43 que comparte una similitud considerable con el procedimiento aquí presentado, el método propuesto aquí introduce algunas modificaciones importantes. Por ejemplo, en este caso, el ARNc de OR y Orco se premezcla y se alícuota en muestras de pequeño volumen inmediatamente después de la síntesis y se alma...

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Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este proyecto contó con el apoyo de una adjudicación de la Estación Experimental Agrícola de Alabama (AAES) Subvenciones Multiestatales/Hatch ALA08-045, ALA015-1-10026 y ALA015-1-16009 a N.L.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
placa de cultivo celular de 24 pocillosCytoOneCC7682-7524Se utiliza para el cultivo de ovocitos
Rana de uñas africanaNascoLM00535Se utiliza para recolectar ovocitos de Xenopus
Electrodo de alambre Ag/AgClWarner Instruments64-1282Utilizado para microelectrodos
Clampex 10.3AxonN.A.Se utiliza para la grabación de señales
Ajuste de abrazadera 10.3Axon Instruments Inc.N.D.Se utiliza para el análisis de datos
Colagenasa BSigma 11088815001Se utiliza para la digestión de ovocitos
Digidata DigitalizadorAxon CNSDigidata 1440ASe utiliza para la adquisición de datos
E.Z.N.A. Plasma DNA Mini kitOmegaD6942-01Utilizado para la preparación de plásmidos
Etil-M-aminobenzoato Sal de metanosulfonatoSigma886-86-2Utilizado para anestesiar ranas
Vidrio capilarFHC30-30-1Utilizado para microinyección
Capilar de vidrioWarner Instruments64-0801Utilizado para la preparación de microelectrodos
GyroMini Mezclador de nutaciónLabnetS0500Utilizado para la digestión de ovocitos
Cámaras de crecimiento de insectosCaron Productsmodelo 6025Utilizado para la incubación de ovocitos
Microscopio LeicaS6 DSe utiliza para cortar antenas de mosquitos
Fuente de luzSchottA20500Proporcionar fuentes de luz para la observación
Soporte magnéticoNarishigeGJ-1Se utiliza para sujetar el electrodo de referencia
MicromanipuladorLeica 115378Se utiliza para el movimiento menor del electrodo
Extractor de microtubosSuttermodelo P-97Se utiliza para extraer capilares
Biseladora de micropipetasSuttermodelo BV-10Se utiliza para afilar capilares
mMESSAGE mMACHINE T7kit InvitrogenAM1344Se utiliza para sintetizar cRNA
Nanoject II Inyector de nanolitros automáticoDrummond3-000-204Se utiliza para microinyección
Oligo d(T)20-primed SuperScript IV sistema de síntesis de primera cadenaInvitrogen18091050 utilizado para síntesis de ADNc
Microscopio OlympusOlympusSZ61Utilizado para microinyección
One Shot TOP10 Células de E. coli químicamente competentesInvitrogenC404003Utilizado para la transformación
Amplificador de pinza para ovocitosInstrumentsmodelo OC-725CUtilizado para la grabación TEVC
Kit de extracción de gel QIAquick Qiagen28704Utilizado para gel purificación
TMC Mesa de aislamiento de vibracionesTMC63-500Se utiliza para aislar la vibración del equipo
TURBO Kit sin ADNInvitrogenAM1907Se utiliza para eliminar la DNasa y otros iones en el ARN
Warner

Referencias

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