Aquí presentamos un método de limpieza de tejido hidrofóbico que permite la visualización de moléculas objetivo como parte de estructuras cerebrales intactas. Esta técnica ha sido validada para el control de F344/N y ratas transgénicas VIH-1 de ambos sexos.
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Artículo de método
Un método de limpieza de tejido hidrófobo para el tejido cerebral de rata
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Resumen
Resumen
Los métodos de limpieza de tejido hidrofóbico son procedimientos fácilmente ajustables, rápidos y de bajo costo que permiten el estudio de una molécula de interés en muestras de tejido inalteradas. Los procedimientos tradicionales de inmunoetiquetado requieren cortar la muestra en secciones delgadas, lo que restringe la capacidad de etiquetar y examinar estructuras intactas. Sin embargo, si el tejido cerebral puede permanecer intacto durante el procesamiento, las estructuras y los circuitos pueden permanecer intactos para el análisis. Los métodos de limpieza previamente establecidos toman un tiempo significativo para limpiar completamente el tejido, y los productos químicos agresivos a menudo pueden dañar los anticuerpos sensibles. El método iDISCO elimina rápida y completamente el tejido, es compatible con muchos anticuerpos y no requiere equipo de laboratorio especial. Esta técnica fue validada inicialmente para su uso en tejido de ratones, pero el protocolo actual adapta este método a la imagen de hemisferios de cerebros de ratas de control y transgénicos. Además de esto, el protocolo actual también realiza varios ajustes al protocolo preexistente para proporcionar imágenes más claras con menos manchas de fondo. Los anticuerpos para Iba-1 y tirosina hidroxilasa se validaron en la rata transgénica VIH-1 y en ratas control F344/N utilizando el actual método de limpieza de tejido hidrófobo. El cerebro es una red entrelazada, donde las estructuras trabajan juntas más a menudo que separadamente unas de otras. Analizar el cerebro como un sistema completo en lugar de una combinación de piezas individuales es el mayor beneficio de todo este método de limpieza cerebral.
Introducción
Se han validado varias técnicas de limpieza de tejidos para su uso en el cerebro: hidrogel, hidrófilo e hidrófobo. Estas técnicas tienen como objetivo hacer que un tejido sea transparente a través de la delipidación, la decoloración y la descalcificación a través de la administración de disolventes. Una vez que el índice de refracción de la muestra de tejido coincide con el índice de refracción del medio de imagen elegido, se puede obtener una imagen clara de la muestra. Las técnicas basadas en hidrogel, como CLARITY, aseguran las biomoléculas en el tejido uniéndolas a hidrogeles a base de acrilo, lo que evita el daño estructural y la pérdida de proteínas
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Protocolo
Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur.
1. Preparación de la solución de stock
- Solución 1 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado añadir 100 mL de solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS) y 2 mL de Tritón X-100.
- Solución 2 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado, añadir 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 y 1 mL de solución stock de heparina de 10 mg/mL.
- Solución 3 (500 ml): A 400 ml de solución 1, agregue 11,5 g de glicina y 100 ml de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Solución 4 (50 mL): A....
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Resultados
La limpieza completa de grandes secciones de tejido cerebral de rata F344 / N y VIH-1 se logró utilizando este protocolo de limpieza de tejido hidrófobo modificado. La Figura 1 muestra una imagen confocal típica para TH en la región de la sustancia negra. La Figura 1A representa la tinción densa y positiva. Las áreas densas como estas se pueden analizar enfocando a través del plano "Z" para confirmar la tinción positiva y la morfología celular adecuada.
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Discusión
La limpieza de tejidos ofrece una solución a las limitaciones del protocolo IHC tradicional. Una muestra que es transparente minimiza la dispersión y absorción de la luz, lo que proporciona acceso óptico a nivel celular a los tejidos intactos18,19. Las técnicas de limpieza de tejidos vuelven un tejido transparente a través de la delipidación, decoloración y descalcificación con la administración de disolventes. Una vez que el índice de refracción de la muestra de.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por subvenciones de los NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 y por T32 Training Grant 5T32GM081740
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Toxina del Cólera Subunidad B (Recombinante), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-500 | |
| Cabra anti-conejo Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Suero de cabra | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| Heparina | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 anticuerpo primario | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil epoxi | VWR | 70730-062 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP2944-100 | |
| Máquina de perfusión | VWR | 70730-062 | mini bomba de caudal variable |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-3KG | |
| TH anticuerpo primario | Millipore Sigma | AB152 | |
| TritonX-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Tween-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
Referencias
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.
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Reimpresiones y permisos
