Method Article

Un método de limpieza de tejido hidrófobo para el tejido cerebral de rata

DOI:

10.3791/61821

⸱

December 23rd, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un método de limpieza de tejido hidrofóbico que permite la visualización de moléculas objetivo como parte de estructuras cerebrales intactas. Esta técnica ha sido validada para el control de F344/N y ratas transgénicas VIH-1 de ambos sexos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los métodos de limpieza de tejido hidrofóbico son procedimientos fácilmente ajustables, rápidos y de bajo costo que permiten el estudio de una molécula de interés en muestras de tejido inalteradas. Los procedimientos tradicionales de inmunoetiquetado requieren cortar la muestra en secciones delgadas, lo que restringe la capacidad de etiquetar y examinar estructuras intactas. Sin embargo, si el tejido cerebral puede permanecer intacto durante el procesamiento, las estructuras y los circuitos pueden permanecer intactos para el análisis. Los métodos de limpieza previamente establecidos toman un tiempo significativo para limpiar completamente el tejido, y los productos químicos agresivos a menudo pueden dañar los anticuerpos sensibles. El método iDISCO elimina rápida y completamente el tejido, es compatible con muchos anticuerpos y no requiere equipo de laboratorio especial. Esta técnica fue validada inicialmente para su uso en tejido de ratones, pero el protocolo actual adapta este método a la imagen de hemisferios de cerebros de ratas de control y transgénicos. Además de esto, el protocolo actual también realiza varios ajustes al protocolo preexistente para proporcionar imágenes más claras con menos manchas de fondo. Los anticuerpos para Iba-1 y tirosina hidroxilasa se validaron en la rata transgénica VIH-1 y en ratas control F344/N utilizando el actual método de limpieza de tejido hidrófobo. El cerebro es una red entrelazada, donde las estructuras trabajan juntas más a menudo que separadamente unas de otras. Analizar el cerebro como un sistema completo en lugar de una combinación de piezas individuales es el mayor beneficio de todo este método de limpieza cerebral.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se han validado varias técnicas de limpieza de tejidos para su uso en el cerebro: hidrogel, hidrófilo e hidrófobo. Estas técnicas tienen como objetivo hacer que un tejido sea transparente a través de la delipidación, la decoloración y la descalcificación a través de la administración de disolventes. Una vez que el índice de refracción de la muestra de tejido coincide con el índice de refracción del medio de imagen elegido, se puede obtener una imagen clara de la muestra. Las técnicas basadas en hidrogel, como CLARITY, aseguran las biomoléculas en el tejido uniéndolas a hidrogeles a base de acrilo, lo que evita el daño estructural y la pérdida de proteínas1. Sin embargo, las técnicas de hidrogel utilizan productos químicos agresivos que tienen el potencial de dañar tejidos más frágiles, y las muestras de tejido más densas pueden no ser compatibles con el protocolo de hidrogel. Ciertas técnicas de hidrogel pueden requerir equipos costosos o conducir a la expansión del tejido. Las técnicas hidrófilas, como CUBIC, preservan la estructura 3D a través de la formación de enlaces de hidrógeno dentro del tejido2. La expansión del tejido también puede ocurrir en cierto protocolo hidrófilo. La capacidad de limpieza de las técnicas hidrofílicas a menudo no coincide con la capacidad que tienen las técnicas hidrofóbicas, lo cual es importante para tejidos más densos y gruesos3.

Las técnicas hidrofóbicas suelen ser rápidas, no requieren equipos especiales y producen una muestra que es fácil de manejar y almacenar. iDISCO es una técnica hidrofóbica que elimina la contracción que puede producirse en otros protocolos hidrófobos. Originalmente, la técnica de limpieza de tejidos iDISCO fue descrita por Renier et al.4 para los embriones y órganos densos y adultos de ratones. Esta técnica elimina el agua del tejido en el paso inicial de deshidratación, reduciendo así la dispersión de la luz. El tejido se permeabiliza durante el pretratamiento para permitir la penetración profunda de anticuerpos. Los colorantes Alexa Fluor en el espectro rojo lejano se utilizan para el inmunoetiquetado para evitar la autofluorescencia del tejido en longitudes de onda más bajas5. El tejido que se ha sometido a protocolos de limpieza hidrofóbica se puede manejar fácilmente y se puede obtener imágenes varias veces debido a la longevidad de los tintes Alexa Fluor. Si se almacenan adecuadamente, los tejidos pueden proporcionar imágenes durante meses a un año después del procesamiento inicial.

En el presente protocolo, el anticuerpo tirosina hidroxilasa (TH), el anticuerpo Iba1 y la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) se utilizaron en el control masculino y femenino y en los cerebros de ratas transgénicas (Tg) del VIH-1. La rata VIH-1 Tg posee siete de los nueve genes que componen el genoma viral del VIH-1, lo que conduce a un modelo no infeccioso de exposición a largo plazo a la proteína VIH-16,7,8. Las alteraciones dopaminérgicas se han demostrado previamente en la rata VIH-1 Tg, y el VIH-1 en sí es una enfermedad inflamatoria, por lo que la elección del anticuerpo fue relevante para el diseño experimental9,10,11,12. CTB es un trazador que se adhiere a las neuronas a través de la unión gangliósido y se puede utilizar para rastrear proyecciones aferentes en el cerebro. CTB se ha utilizado previamente para estudiar proyecciones desde el núcleo accumbens hasta el área de la sustancia negra, dos áreas del cerebro muy involucradas con las vías dopaminérgicas13,14,15.

En este protocolo, TH servirá como marcador para la producción de dopamina, e Iba1 marcará la microglía activada. El anticuerpo TH utilizado marca selectivamente una sola banda a aproximadamente 62 kDa que corresponde a la tirosina hidroxilasa. El anticuerpo Iba1 corresponde a la secuencia carboxi-terminal Iba1. Ambos anticuerpos fueron criados en conejo y eran policlonales. CTB se utilizará para el rastreo retrógrado de neuronas desde el área del núcleo accumbens hasta el área de la sustancia negra. El protocolo actual también ofrece una guía para el ajuste del protocolo iDISCO original de dos maneras distintas: 1) reducción general de la tinción de fondo mediante el cambio de los reactivos séricos en los pasos de bloqueo, y 2) escalado del tiempo de incubación para que sea adecuado para muestras de tejido más grandes. En general, el presente protocolo proporciona evidencia continua de que las técnicas de limpieza hidrofóbica son factibles en los tejidos cerebrales de la rata, no tienen interacciones perjudiciales discernibles con las proteínas virales del VIH-1 y son compatibles con el anticuerpo TH, el anticuerpo Iba1 y el CTB.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur.

1. Preparación de la solución de stock

  1. Solución 1 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado añadir 100 mL de solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS) y 2 mL de Tritón X-100.
  2. Solución 2 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado, añadir 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 y 1 mL de solución stock de heparina de 10 mg/mL.
  3. Solución 3 (500 ml): A 400 ml de solución 1, agregue 11,5 g de glicina y 100 ml de dimetilsulfóxido (DMSO).
  4. Solución 4 (50 mL): A 42 mL de Solución 1, agregue 3 mL de suero correspondiente y 5 mL de DMSO.
  5. Solución primaria de anticuerpos (50 ml): A 46 ml de solución 2, agregue 2,5 ml de DMSO y 1,5 ml de suero correspondiente.
  6. Solución secundaria de anticuerpos (50 ml): A 48,5 ml de solución 2, añadir 1,5 ml de suero correspondiente.
    NOTA: Para la solución 4, solución primaria y solución secundaria, use un suero que corresponda con el anticuerpo secundario (por ejemplo, cabra, caballo, bovino).

2. Preparación de la muestra

NOTA: Realice los pasos 2.1 a 2.7 en una campana extractora de humos debido a limitar la exposición a PFA.

  1. Anestesiar profundamente a las ratas jóvenes (3-6 semanas) usando sevoflurano; proceda a 2.2 cuando la rata no responda y no responda al pellizco del dedo del dedo del dedo del día y la cola.
  2. Coloque a la rata en posición supina y haga una incisión a través de la pared abdominal con un par de tijeras Iris.
  3. Corta a través de la parte inferior de la caja torácica hasta la clavícula a ambos lados de la caja torácica con tijeras Mayo.
  4. Coloque el esternón y las costillas lejos del corazón y los pulmones con un hemostático.
  5. Perfora el ventrículo izquierdo con una aguja de 23 G conectada a una bomba de perfusión y corta la aurícula derecha con tijeras Iris.
  6. Realizar perfusión transcárdica con aproximadamente 75 mL de 100 mM (1x) PBS.
  7. Continuar la perfusión transcárdica con aproximadamente 100 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) tamponado en 1x PBS.
  8. Retire el cerebro del cráneo usando pórceps.
  9. Coloque el cerebro en posición sagital y corte en 4 secciones iguales (aproximadamente 3 mm de ancho) usando una cuchilla de afeitar y una matriz cerebral de rata.
  10. Fije cada sección en 4% de PFA en 1x PBS en un tubo de plástico sellado de 5 ml durante la noche a 4 ° C en un agitador.
  11. Continúe fijando en 4% PFA en 1x PBS a temperatura ambiente (RT) en un agitador durante 1 h.
  12. Lave cada sección con 1x PBS en RT durante 30 min, 3 veces.

3. Deshidratación y despigmentación

  1. Incubar la muestra en una solución de metanol al 20%/80% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  2. Incubar la muestra en una solución de metanol al 40%/60% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  3. Incubar la muestra en una solución de metanol al 60%/40% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  4. Incubar la muestra en una solución de metanol al 80%/20% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  5. Incubar la muestra en metanol al 100% durante 1 h en RT. Repetir con más 100% de metanol, incubando durante 1 h en RT.
  6. Enfriar la muestra en metanol al 100% a 4° C durante aproximadamente 10 min.
  7. Prepare una solución de diclorometano al 66% (DCM)/metanol al 33%.
  8. Incubar la muestra durante la noche en la solución de DCM/metanol en RT, con agitación.
  9. Lavar con metanol en RT durante 30 min, 2 veces.
  10. Enfriar la muestra en metanol al 100% a 4° C durante aproximadamente 10 min.
  11. Blanquear en peróxido de hidrógeno al 5% refrigerado y recién preparado en metanol durante la noche a 4 ° C.
  12. Incubar la muestra en una solución de metanol al 80%/20% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  13. Incubar la muestra en una solución de metanol al 60%/40% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  14. Incubar la muestra en una solución de metanol al 40%/60% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  15. Incubar la muestra en una solución de metanol al 20%/80% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  16. Incubar la muestra en 1x PBS durante 1 h en RT.
  17. Lavar en solución 1 durante 1 h en RT, 2 veces.

4. Etiquetado de la subunidad B de la toxina del cólera

  1. Inserte la punta de la aguja de la jeringa de 1 ml en el sitio del núcleo accumbens.
  2. Inyecte lentamente 2,5 μL de biotina-CTB al 1% durante 20 s.
  3. Deje la punta de la aguja en su lugar durante 1 minuto y retire lentamente durante 10 s para evitar fugas.

5. Aplicación de anticuerpos

  1. Incubar la muestra en la Solución 3 durante 2 días a 37 °C en un baño de agua.
  2. Incubar la muestra en la Solución 4 durante 2 días a 37 °C en un baño de agua.
  3. Incubar con anticuerpo primario durante 7 días a 37 °C en un baño de agua.
  4. Lavar en Solución 2 por 5 veces, incubando 1 h por lavado. Almacene en la Solución 2 en RT durante la noche.
  5. Incubar con anticuerpos secundarios durante 7 días a 37 °C en baño de agua.
  6. Lavar en solución 2 por 5 veces, incubando 1 h por lavado; almacenar en la Solución 2 en RT durante la noche.
    NOTA: Todos los pasos a partir de 5.6 en adelante, incluido el almacenamiento final, deben realizarse con poca luz. Los tubos de muestra se pueden blindar con papel de aluminio. Las concentraciones utilizadas para los anticuerpos en este protocolo fueron: TH a 1:100, Iba1 a 1:200 y el anticuerpo secundario a 1:100. Agregue la Solución 2 adicional a los pasos 5.1-5.6 para asegurarse de que los tubos estén completamente llenos.

6. Limpieza de tejidos

  1. Incubar la muestra en una solución de metanol al 20%/80% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  2. Incubar la muestra en una solución de metanol al 40%/60% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  3. Incubar la muestra en una solución de metanol al 60%/40% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  4. Incubar la muestra en una solución de metanol al 80%/20% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  5. Incubar la muestra en metanol al 100% durante 1 h en RT.
  6. Incubar en fresco 100% metanol durante la noche en RT.
  7. Incubar en 66% DCM/33% metanol durante 3 h, con agitación, a temperatura ambiente.
  8. Incubar en éter dibencil (DBE) sin agitar. Deje la muestra en DBE hasta que esté clara y guárdela en DBE hasta la obtención de imágenes.

7. Montaje

  1. Obtenga una cámara impresa en 3D hecha de resina Visijet M3 Crystal (plantillas disponibles en el sitio web de idisco.info).
  2. Asegure la cámara a un portaobjetos de microscopio con un epoxi.
  3. Coloque la muestra en el espacio cuadrado en el centro de la cámara.
  4. Llene la cámara completamente con DBE.
  5. Coloque una cubierta de 0,17 mm de espesor sobre la cámara y aplique presión hasta que la cubierta tenga contacto completo con las paredes de la cámara.
  6. Selle los bordes de la cubierta a la cámara con el epoxi.
  7. Gire la cámara para permitir que las burbujas de aire escapen de la entrada de llenado.
  8. Llene la cámara con DBE adicional.
  9. Selle la entrada de relleno con epoxi y deje curar.
    NOTA: El exceso de DBE se derramará durante el montaje.

8. Imágenes

  1. Utilice un sistema de microscopio confocal para realizar el escaneo z a un aumento de 4x (vea el video 3Dadjunto).
  2. Lograr la excitación fluorescente de la muestra utilizando un conjunto láser para emitir a una longitud de onda similar a la longitud de onda especificada por el anticuerpo secundario. La excitación TH se logró utilizando un conjunto de láser HeNe para emitir a 632 nm.
  3. Configure el detector a una longitud de onda cercana a la emisión del láser. Para el protocolo actual, el detector para TH se estableció en 650 nm.
  4. Aumente la ganancia del detector hasta que haya una señal visible. La ganancia de 650LP para imágenes se estableció en 7.50 B.
  5. Usando la opción Escanear en el software de imágenes confocales, mueva la etapa del microscopio hasta que la muestra se enfoque.
  6. Navegue por el tejido en todas las llanuras y obtenga imágenes individuales o imágenes de pila z utilizando el software de imágenes confocales.
  7. Una vez que se completen las imágenes, retire la muestra de la cámara. Vuelva a colocarlo en un tubo completamente lleno de DBE y guárdelo en RT en un lugar oscuro, preferiblemente cubierto de papel de aluminio.
    NOTA: Las muestras se pueden volver a montar y tomar imágenes siempre que la señal de florescencia siga siendo fuerte.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La limpieza completa de grandes secciones de tejido cerebral de rata F344 / N y VIH-1 se logró utilizando este protocolo de limpieza de tejido hidrófobo modificado. La Figura 1 muestra una imagen confocal típica para TH en la región de la sustancia negra. La Figura 1A representa la tinción densa y positiva. Las áreas densas como estas se pueden analizar enfocando a través del plano "Z" para confirmar la tinción positiva y la morfología celular adecuada.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La limpieza de tejidos ofrece una solución a las limitaciones del protocolo IHC tradicional. Una muestra que es transparente minimiza la dispersión y absorción de la luz, lo que proporciona acceso óptico a nivel celular a los tejidos intactos18,19. Las técnicas de limpieza de tejidos vuelven un tejido transparente a través de la delipidación, decoloración y descalcificación con la administración de disolventes. Una vez que el índice de refracción de la muestra de...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por subvenciones de los NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 y por T32 Training Grant 5T32GM081740

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Toxina del Cólera Subunidad B (Recombinante), Alexa Fluor 488InvitrogenC34775
DBESigma-Aldrich108014-1KG
DCMSigma-Aldrich270997-100mL
DMSOSigma-Aldrich472301-1L
GlycineFisher ChemicalG46-500
Cabra anti-conejo Alexa Fluor Plus 647InvitrogenA32733
Suero de cabraSigma Life ScienceG9023-10mL
HeparinaAcros Organics41121-0010
Iba1 anticuerpo primarioFUJIFILM Wako019-19741
Kwik-sil epoxiVWR70730-062
MetanolSigma-Aldrich34860-1L-R
PBSFisher BioreagentsBP2944-100
Máquina de perfusiónVWR70730-062mini bomba de caudal variable
PFASigma-Aldrich158127-3KG
TH anticuerpo primarioMillipore SigmaAB152
TritonX-100Fisher BioreagentsBP151-500
Tween-20Fisher BioreagentsBP337-500

References

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