Purificación de tubulina con modificaciones posttranslacionales controladas e isotipos de fuentes limitadas por ciclos de polimerización-despolimerización

Resumen

Este protocolo describe la purificación de la tubulina a partir de fuentes pequeñas/medianas como células cultivadas o cerebros de ratón único, utilizando ciclos de polimerización y despolimerización. La tubulina purificada se enriquece en isotipos específicos o tiene modificaciones posttranslacionales específicas y se puede utilizar en ensayos de reconstitución in vitro para estudiar dinámicas e interacciones de microtúbulos.

Resumen

Un aspecto importante de los estudios del citoesqueleto de microtúbulos es la investigación del comportamiento de los microtúbulos en experimentos de reconstitución in vitro. Permiten el análisis de las propiedades intrínsecas de los microtúbulos, como la dinámica, y sus interacciones con proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs). El "código de tubulina" es un concepto emergente que apunta a diferentes isotipos de tubulina y varias modificaciones posttranslacionales (PTM) como reguladores de propiedades y funciones de microtúbulos. Para explorar los mecanismos moleculares del código de tubulina, es crucial realizar experimentos de reconstitución in vitro utilizando tubulina purificada con isotipos y PTM específicos.

Hasta la fecha, esto era técnicamente desafiante como la tubulina cerebral, que es ampliamente utilizada en experimentos in vitro, alberga muchos PTM y tiene una composición isotipo definida. Por lo tanto, desarrollamos este protocolo para purificar la tubulina de diferentes fuentes y con diferentes composiciones isotipos y PTMs controlados, utilizando el enfoque clásico de los ciclos de polimerización y despolimerización. En comparación con los métodos existentes basados en la purificación de la afinidad, este enfoque produce tubulina pura y competente para la polimerización, ya que la tubulina resistente a la polimerización o despolimerización se descarta durante los sucesivos pasos de purificación.

Describimos la purificación de la tubulina de las líneas celulares, cultivada ya sea en suspensión o como cultivos adherentes, y de cerebros de ratón únicos. El método describe primero la generación de masa celular tanto en la suspensión como en los ajustes adherentes, el paso de lisis, seguido de las sucesivas etapas de purificación de la tubulina mediante ciclos de polimerización-despolimerización. Nuestro método produce tubulina que se puede utilizar en experimentos que abordan el impacto del código de tubulina en las propiedades intrínsecas de microtúbulos e interacciones de microtúbulos con proteínas asociadas.

Introducción

Los microtúbulos desempeñan un papel crítico en muchos procesos celulares. Dan a las células su forma, construyen husillos meioticos y mitoticos para la segregación cromosómica, y sirven como pistas para el transporte intracelular. Para realizar estas diversas funciones, los microtúbulos se organizan de diferentes maneras. Una de las preguntas intrigantes en el campo es entender los mecanismos moleculares que permiten que los microtúbulos conservados estructural y evolutivamente se adapten a esta plétora de organizaciones y funciones. Un mecanismo potencial es la diversificación de los microtúbulos, que se define por el concepto conocido como el 'código de tubulina'

Protocolo

El cuidado y uso de animales para este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Comunidad Europea (2010/63/UE). Los procedimientos experimentales fueron aprobados específicamente por el comité de ética del Institut Curie CEEA-IC #118 (autorización Nº 04395.03 dada por la Autoridad Nacional) en cumplimiento de las directrices internacionales.

1. Preparación de reactivos para purificación de tubulina

NOTA: Todos los tampones utilizados para la purificación de la tubulina deben contener sales de potasio y NO sales de sodio³⁰.

1. Preparar 1 L de medio completo: el med....

Resultados

El objetivo principal de este método es producir tubulina de alta calidad y competente para el montaje en cantidades suficientes para realizar experimentos in vitro repetidos con los componentes purificados. Los microtúbulos ensamblados a partir de esta tubulina se pueden utilizar en ensayos de reconstitución basados en la técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) con microtúbulos dinámicos o estables, en experimentos que prueban dinámicas de microtúbulos, interacciones con MAPs o motores .......

Discusión

El método descrito aquí proporciona una plataforma para generar rápidamente tubulina de alta calidad y competente para el montaje en cantidades medianas y grandes a partir de líneas celulares y cerebros de ratón único. Se basa en el protocolo estándar de oro de purificación de tubulina de cerebros bovinos utilizados en el campo durante muchos años^16,17. Una ventaja particular del enfoque es el uso de cultivos de suspensión de células HeLa S3, que, una vez estable.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1  M MgCl2	Sigma	#M1028
recipientes de cultivo celular de 1 L	Techne F7610		Se utiliza para cultivos giratorios. Nunca revuelva las botellas giratorias vacías. Cuando haya frascos giratorios en la incubadora de cultivos celulares, mantenga siempre las válvulas laterales de los frascos giratorios ligeramente abiertas para facilitar el equilibrio de los medios con la incubadora. s atmósfera. Después de su uso, llene las botellas giratorias inmediatamente con agua del grifo para evitar que se sequen las celdas restantes en las paredes de la botella. Lavar las botellas con agua desionizada, añadir aprox. 200 ml de agua desionizada y autoclave. Bajo una campana de cultivo celular estéril, retire el agua y deje que las botellas se sequen completamente, aún debajo de la campana, durante varias horas. Nunca use detergentes para limpiar las botellas giratorias porque cualquier rastro de detergente puede ser perjudicial para las células.
Tubos de 1,5 y 2 ml,
tubos de fondo redondo de 14 ml,
			cultivo estériles de 15 cm de diámetro
tubos
, 2-mercaptoetanol;	Sigma	#M3148	2-mercaptoetanol es tóxico y debe usarse bajo el capó.
Fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo	Sigma
40% de acrilamida	Bio-Rad	#161-0140
Jeringas de 5, 10 y 20 ml Pipetas
estériles de 5 ml, 10 ml, 25 ml Tubos
con tapón de rosca de 50 ml Persulfato
de amonio (APS)	Sigma	#A3678
Anticuerpo anti-alfa-tubulina, 12G10	Desarrollado por J. Frankel y M. Nelson, obtenido del Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo, desarrollado bajo los auspicios del NICHD, y mantenido por la Universidad de Iowa		dilución: 1/500
Anticuerpo anti-tubulina glutamilada, GT335	AdipoGen	#AG-20B-0020	dilución: 1/20.000
Aprotinin	Sigma
Balance (0,1 – 10 g)
Botellas de polipropileno Beckman de 1 l			Para la recolección de cultivos giratorios
Centrífuga			Para la recolección de cultivos giratorios
Agitador biológico	Techne MCS-104L		Instalado en la incubadora de cultivos celulares (para cultivos giratorios), 25 rpm para células Hela S3 y HEK 293
Bis N,N'-Metileno-Bis-Acrilamida	Bio-Rad	#161-0201
Licuadora IKA Ultra-Turrax®			Para lisar el tejido cerebral, utilice una sonda de 5 mm, con la máquina ajustada a la potencia 6 o 7. Mezcle el tejido cerebral 2-3 veces durante 15 s en hielo.
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma
Azul de bromofenol	Sigma	#1.08122
Carboxipeptidasa A (CPA)	Sigma	#C9268	Concentración: 1.7  U/µ l
Campana de
Incubadora de cultivo celular establecida en 37 grados; C, 5%
(DMSO)	Sigma	#D8418	DMSO puede mejorar la permeabilidad celular y cutánea de otros compuestos. Evite el contacto y use protección para la piel y los ojos.
DMEM medio	Tecnologías de la Vida	#41965062
TDT, DL-Dithiothreitol	Sigma
EDTA	Euromedex	#EU0007-C
EGTA	Sigma
Absoluto de etanol	Fisher Chemical	#E/0650DF/15
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma
prensa francesa de celda de presión	Thermo electron corporation	#FA-078A	con una celda #FA-032; para lisar grandes cantidades de celdas. Ajustado en una relación media, y la presión manométrica de 1.000 psi (corresponde a 3.000 psi dentro de la cámara de interrupción).
Glicerol	Productos químicos de VWR	#24388.295
Glycine	Sigma	#G8898
GTP	Sigma
Bloque calefactor	Stuart
Células Hela		ATCC® CCL-2 y comercio;
Células Hela S3	ATCC	ATCC® CCL-2.2 y comercio;
Ácido clorhídrico (HCl)	VWR	#20252.290
Microscopio invertido			Con fluorescencia si se va a verificar la transfección celular
Isopropanol	VWR	#20842.298
jetPEI	Polyplus	#101
Rotor JLA-8.1000			Para la recolección de cultivos giratorios
KOH	Sigma	#P1767	KOH es corrosivo y causa quemaduras; use protección para los ojos y la piel.
L-Glutamina	Tecnologías de la Vida	#25030123
Centrífuga de laboratorio para tubos de 50 ml	Sigma	4-16 K
Leupeptin	Sigma	#L2884
Nitrógeno líquido
Micropipetas p2.5, p10, p20, p100, p200 y p1000 y puntas
Micromortillas	Eppendorf	#0030 120.973
Tejido cerebral de ratón			El cuidado y uso de los animales para este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Comunidad Europea (2010/63/UE). Los procedimientos experimentales fueron específicamente aprobados por el comité de ética del Institut Curie CEEA-IC #118 (autorización nº 04395.03 dada por la Autoridad Nacional) de acuerdo con las directrices internacionales.
Agujas 18G x 1 y frac12; ” (1,2 X 38 mm	Terumo	#18G
Agujas 20G x 1 y frac12; ” (0,9 X 38 mm	Terumo	#20G
Agujas 21G x 4 & frac34; ” (0,8 X 120 mm	B.Braun	#466 5643
Parafilm
PBS	Tecnologías de la Vida	#14190169
Penicilina-Estreptomicina	Tecnologías de la Vida	#15140130
pH-metro
de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)	Sigma	#P7626 polvo de	PMSF es peligroso. Use protección para la piel y los ojos cuando prepare soluciones de PMSF.
PIPES	Sigma
Rotores de
	Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; y equipo de electroforesis TLA 55
SDS-PAGE	Bio-Rad
SDS, sulfato de dodecilo de sodio	VWR	#442444H	Para preparar el tampón Laemmeli
SDS, sulfato de dodecilo de sodio	Sigma	#L5750	Para la preparación de geles 'TUB' SDS-PAGE
Sonicator	Branson	#101-148-070	Se utiliza para lisar células cultivadas como cultivos adherentes. Utilice una sonda de 6,5 mm de diámetro, ajuste el sonicador a " Control de salida" 1, " Ciclo de trabajo" 10% y tiempo dependiendo del tipo de célula utilizada.
Centrífuga de sobremesa para tubos de 1,5 ml	Eppendorf	5417R
TEMED, N, N, N′, N′-Tetrametiletilendiamina	Sigma	#9281
Trichostatina A (TSA)	Sigma	#T8552
Triton X-100	Sigma
Trizma base (Tris)	Sigma
Tripsina	Life Technologies	#15090046
Rotores ultracentrífugos		Rotores TLA-55, TLA-100.3 y 70.1 Ti ajustados	a 4° C o 30 grados; C en función de la necesidad del experimento
Tubos de ultracentrífuga	Beckman	#357448	para usar con rotor TLA-55
Tubos de ultracentrífuga	Beckman	#349622	rotor TLA-100.3
	Beckman	#355631	para usar con rotor 70.1 Ti
Ultracentrífugas	Beckman	Optima L80-XP (o equivalente) y Optima MAX-XP (o equivalente)	Ajustado a 4&grad; C o 30 grados; C en función de la necesidad del experimento
			de vórtice
Baño de agua equipado con flotadores o soportes			Ajustado a 30 ° C