El protocolo tiene como objetivo introducir el uso de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo para el monitoreo de reacción múltiple (MRM) de proteínas de muestras clínicas. Hemos proporcionado un flujo de trabajo sistemático desde la preparación de muestras hasta el análisis de datos para muestras clínicas con todas las precauciones necesarias a tomar.
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Artículo de método
Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El análisis proteómico del tejido cerebral humano durante la última década ha mejorado en gran medida nuestra comprensión del cerebro. Sin embargo, los trastornos relacionados con el cerebro siguen siendo un importante contribuyente de muertes en todo el mundo, lo que requiere la necesidad de una comprensión aún mayor de su patobiología. Las técnicas tradicionales basadas en anticuerpos como el western blotting o la inmunohistoquímica sufren de bajo rendimiento, además de ser intensivas en mano de obra y cualitativas o semicuantitativas. Incluso los enfoques convencionales de escopeta basados en espectrometría de masas no proporcionan evidencia concluyente para apoyar una determinada hipótesis. Los enfoques de proteómica dirigida se basan en gran medida en hipótesis y difieren de los enfoques de proteómica de escopeta convencionales que se han utilizado durante mucho tiempo. El monitoreo de reacciones múltiples es uno de esos enfoques específicos que requiere el uso de un espectrómetro de masas especial llamado espectrómetro de masas cuadrupolo en tándem o espectrómetro de masas cuadrupolo triple. En el estudio actual, hemos destacado sistemáticamente los principales pasos involucrados en la realización de un flujo de trabajo exitoso de proteómica basada en espectrometría de masas cuadrupolo en tándem utilizando tejido cerebral humano con el objetivo de introducir este flujo de trabajo a una comunidad de investigación más amplia.
Introducción
Durante la última década, los rápidos desarrollos en espectrometría de masas (EM) junto con una mayor comprensión de las técnicas de cromatografía han ayudado en gran medida en el avance de la proteómica basada en la EM. Las técnicas basadas en la biología molecular, como el western blotting y la inmunohistoquímica, han sufrido durante mucho tiempo problemas de reproducibilidad, tiempo de respuesta lento, variabilidad entre observadores y su incapacidad para cuantificar con precisión las proteínas, por nombrar algunos. Con este fin, la sensibilidad superior de los enfoques de proteómica de alto rendimiento continúa ofreciendo a los biólogos moleculares una herramienta....
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Protocolo
Este estudio involucra muestras de tejido cerebral de participantes humanos, revisadas y aprobadas por TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Los participantes dieron su consentimiento informado y por escrito para participar en este estudio.
1 Extracción de proteínas del tejido cerebral
- Pesar alrededor de 50 mg de tejido cerebral y lavar el tejido con 300 μL de solución salina tampón de fosfato 1x (PBS) usando una micropipeta.
NOTA: Este paso se realiza para eliminar cualquier sangre en la superficie externa del tejido y debe repetirse si es necesario. Es aconsejable eliminar la mayor cantidad de sangre del tejido como sea posib....
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Resultados
Realizamos una cuantificación relativa de 3 proteínas de 10 muestras, 5 muestras de cada grupo de pacientes con anomalías en el cerebro. Estas proteínas incluyen la apolipoproteína A-I (APOA-I), la vimentina (VIM) y la nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT), que se sabe que desempeñan diversas funciones en las células cerebrales. El análisis posterior a la ejecución de los datos se realizó utilizando Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Se monitorizaron un total de 10 péptidos correspondientes a 3 proteínas. Estos incl.......
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Discusión
Técnicas como la inmunohistoquímica y el Western blotting fueron consideradas como los estándares de oro para la validación de objetivos de proteínas durante muchos años. Estos métodos encuentran uso incluso hoy en día con pequeñas modificaciones en el protocolo y poca dependencia de la tecnología, lo que los hace muy engorrosos y tediosos. Además de esto, también implican el uso de anticuerpos costosos que no siempre muestran la misma especificidad en todos los lotes y requieren una gran cantidad de experiencia. Además,.......
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Divulgaciones
Los autores recibieron el apoyo de Thermofisher para la tarifa de publicación.
Agradecimientos
Reconocemos el Proyecto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), proyecto #34_IITB a las instalaciones de SS y MASSFIITB en IIT Bombay con el apoyo del Departamento de Biotecnología (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para llevar a cabo todos los experimentos relacionados con la EM.
Extendemos nuestro agradecimiento especial al Sr. Rishabh Yadav por hacer y editar todo el video y al Sr. Nishant Nerurkar por su trabajo en la edición del audio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| Acetonitrilo (grado MS) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Albúmina sérica bovina | HiMedia | TC194-25G | |
| Cloruro de calcio | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Ácido fórmico (grado MS) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Yodoacetamida | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (grado MS) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Cloruro de magnesio | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Metanol (grado MS) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Agua de grado MS | Pierce | 51140 | |
| Tampón de fosfato salino | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Cloruro de sodio | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Tripsina (grado MS) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Suministros | |||
| Hypersil Gold C18 columna | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipetas | Gilson | F167380 | |
| Puntas de etapa | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Perlas de sílice | Productos BioSpec | 11079110z | |
| Equipment | |||
| pH | Thermo MultiSkan | ||
| Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| TSQ Altis espectrómetro | de masas Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC - Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Concentrador de vacío | Thermo | Savant ISS 110 |
Referencias
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al.
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Reimpresiones y permisos
