Cultivo tridimensional de adipocitos como modelo para estudiar la remodelación del tejido adiposo blanco inducida por caquexia

Resumen

Este protocolo describe un sistema de cultivo de impresión magnética tridimensional (3D) que permite la disección de la remodelación del tejido adiposo blanco (WAT) inducida por un medio condicionado a partir de células cancerosas. El uso de un sistema de cultivo 3D de adipocitos UCP1+ que expresan una proteína verde fluorescente (GFP) permite el estudio de adipocitos beige que contribuyen a la remodelación del tejido adiposo.

Resumen

La caquexia oncológica (CC) se presenta como un síndrome con múltiples manifestaciones, provocando un marcado desequilibrio metabólico multiorgánico. Recientemente, se ha propuesto que la emaciación caquéctica es estimulada por varios mediadores inflamatorios, que pueden alterar la fisiología integrativa de los tejidos adiposos y otros tejidos como el cerebro y el músculo. En este escenario, el tumor puede sobrevivir a expensas del huésped. En investigaciones clínicas recientes, la intensidad de la depleción de los diferentes depósitos de grasa se ha correlacionado negativamente con el resultado de supervivencia del paciente. Los estudios también han demostrado que varios trastornos metabólicos pueden alterar la remodelación del tejido adiposo blanco (WAT), especialmente en las primeras etapas del desarrollo de la caquexia. La disfunción de WAT resultante de la remodelación tisular contribuye a la caquexia general, y las principales modificaciones en WAT consisten en cambios morfofuncionales, aumento de la lipólisis de adipocitos, acumulación de células inmunitarias, reducción de la adipogénesis, cambios en la población de células progenitoras y el aumento de "nichos" que contienen células beige/brite.

Para estudiar las diversas facetas de la remodelación WAT inducida por la caquexia, en particular los cambios en las células progenitoras y la remodelación beige, el cultivo bidimensional (2D) ha sido la primera opción para los estudios in vitro. Sin embargo, este enfoque no resume adecuadamente la complejidad del WAT. Los ensayos mejorados para la reconstrucción de la TA funcional ex vivo ayudan a comprender las interacciones fisiológicas entre las distintas poblaciones celulares. Este protocolo describe un eficiente sistema de cultivo de tejidos de impresión tridimensional (3D) basado en nanopartículas magnéticas. El protocolo está optimizado para investigar la remodelación de WAT inducida por factores inducidos por caquexia (CIF). Los resultados muestran que un cultivo 3D es una herramienta apropiada para estudiar el modelado WAT ex vivo y puede ser útil para que los cribados funcionales identifiquen moléculas bioactivas para aplicaciones individuales de poblaciones de células adiposas y ayuden al descubrimiento de la terapia anticaquéctica celular basada en WAT.

Introducción

Los organismos vivos están compuestos por células en microambientes 3D con interacción célula-célula y célula-matriz y dinámicas de transporte elaboradas para nutrientes y células ^1,2. Sin embargo, la mayor parte del conocimiento fundamental adquirido en biología celular se ha generado utilizando el cultivo celular monocapa (2D). Aunque el cultivo 2D puede responder a algunas de las preguntas mecanicistas, este enfoque recapitula inadecuadamente el entorno natural en el que residen las células y puede ser incompatible con la predicción de^{una respuesta compleja} a un fármaco. Además, las células detectan su entorno físico a través de la mecanotransducción. De hecho, las fuerzas mecánicas se traducen en señales bioquímicas que, en última instancia, influyen en los patrones de expresión génica y en el destino de la célula. En las últimas décadas, el cultivo de tejidos en 3D ha surgido como una nueva herramienta in vitro que puede imitar el microambiente in vivo con mayor fidelidad. Esto puede evitar algunos escollos mecanicistas generados por los enfoques 2D in vitro³.

La caquexia oncológica (CC) se define como un síndrome con múltiples manifestaciones, causante de un marcado desequilibrio metabólico multiorgánico. Durante el desarrollo de la caquexia, WAT experimenta numerosos cambios morfológicos que resultan en un aumento de la lipólisis de los adipocitos, acumulación de células inmunitarias, reducción de la adipogénesis, cambios en la población de células progenitoras y un aumento de los "nichos" que contienen células beige/brite (remodelación beige)⁴. Sin embargo, recapitular el mecanismo por el cual la caquexia afecta la remodelación de WAT utilizando modelos in vitro presenta un desafío técnico significativo. De hecho, algunos estudios que intentaron investigar la comunicación entre el tumor y el tejido han utilizado el cultivo celular in vitro (2D) monocapa, eludiendo la complejidad del microambiente 3D de WAT.

Aunque varios enfoques experimentales generan cultivo en 3D, se prefieren tres métodos de ensamblaje diferentes para producir adiposferoides: levitación magnética o impresión⁵, caída colgante⁶ y sistemas de andamio de Matrigel⁷. A pesar de ser apropiados para los adiposferoides, estos sistemas tienen ventajas y desventajas y deben elegirse de acuerdo con las características de cada diseño experimental. Con base en las limitaciones mencionadas anteriormente, se utilizó el método de impresión magnética para generar cultivos celulares en 3D⁵. Este método utiliza un ensamblaje de nanopartículas magnéticas que consta de nanopartículas de oro y óxido de hierro, lo que hace que el método de impresión sea adecuado para la mayoría de los tipos de células. Aquí, se utilizaron cultivos celulares en 3D para inducir la adipogénesis y CIF para reproducir la condición ambiental de CC.

Protocolo

1. Incubación de células 2D con nanopartículas magnéticas

1. Cultive cultivos 2D adherentes a ~ 70% de confluencia utilizando procedimientos estándar de cultivo celular.
2. Prepare el ensamblaje de nanopartículas magnéticas. Sácalo del frigorífico y déjalo calentar a temperatura ambiente (20-25 °C) durante unos 15 min¹.
3. Medio mixto: Añadir las nanopartículas magnéticas directamente a 12 mL de medio en placas de cultivo celular de 100 mm. Suspender y volver a suspender el medio unas cuantas veces para obtener una distribución homogénea de las nanopartículas.
   NOTA: El medio aparecerá oscuro debido al color marrón del óxido de hierro. Se recomienda una concentración de 2,5 μL/^cm2 del área de cultivo.
4. Lave la placa de cultivo 2D de 100 mm tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
5. Añada 12 mL del medio mezclado del paso 1.3 a las placas de cultivo celular de 100 mm. Incubar las placas durante la noche en una incubadora (37 °C, 5% CO₂) para permitir la unión de las nanopartículas magnéticas a las células

2. Creación de cultivos 3D con ensamblaje de esferoides en placas de 96 pocillos

1. Después de la incubación durante la noche, lave las células para eliminar cualquier medio residual y nanopartículas magnéticas no adheridas agitando suavemente las placas con 3 x 10 mL de PBS.
2. Aspirar el PBS de la placa de Petri y separar las células mediante incubación con una solución de ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina (EDTA) al 0,25% durante 2-5 min a 37 °C.
3. Mientras espera a que las celdas se desprendan, desinfecte las unidades magnéticas con etanol¹ al 70%.
4. Después de que las células se hayan desprendido, agregue un medio que contenga suero a 4 veces el volumen de la solución de tripsina-EDTA para neutralizar el efecto de la tripsina y luego transfiera la suspensión a un tubo cónico.
5. Centrifugar la suspensión, a 500 × g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tocar el pellet.
   NOTA: Después de la centrifugación, las células deben aparecer de color marrón y las suspensiones celulares en medio deben aparecer más oscuras de lo habitual. Las células deben aparecer salpicadas con las nanopartículas¹.
6. Cuente las celdas en suspensión y calcule el volumen de volúmenes medios necesarios para crear cultivos 3D. En el caso de los adiposferoides, utilice de 5.000 a 10.000 células en 150 μL en placas de 96 pocillos.
7. Con un kit de bioimpresión de 96 pocillos, coloque una placa de 96 pocillos repelente de células en la parte superior de la unidad de esferoide.
8. Pipetee 150 μL de suspensión celular en cada pocillo de la placa de 96 pocillos y cierre la placa para permitir que las celdas se agreguen en el fondo en forma de imán.
9. Deje la placa en la unidad de esferoide en la incubadora durante 1-2 h para producir un esferoide competente.
   NOTA: Estos cultivos deben aparecer densos y marrones y deben imprimirse en la placa (Figura S1). La Figura S2 presenta un flujo de trabajo resumido de los principales pasos de la impresión magnética 3D del ensamblaje de esferoides en placas de 96 pocillos.

3. Inducción de la adipogénesis blanca

1. Preparar los medios de mantenimiento e inducción⁸; Prepare el medio de inducción antes de cada uso.
   1. Prepare un medio de mantenimiento que contenga 5 μg/mL de insulina (10 mg/mL de caldo almacenado a 4 °C durante una semana) y 0,5 μM de rosiglitazona (10 mM de caldo de dimetilsulfóxido (DMSO)).
   2. Prepare un medio de inducción que contenga 125 μM de indometacina a partir de un stock de 0,125 M en etanol, 2 μg/mL de dexametasona a partir de un stock de 2 mg/mL en etanol, 0,5 mM de isobutil-1-metilxantina (IBMX) a partir de un stock de 0,25 M en DMSO y 0,5 μM de rosiglitazona a partir de un stock de 10 mM en DMSO.
      NOTA: Calentar la indometacina a 60 °C para que se disuelva.
2. Después de 24-48 h de impresión de esferoides, sustituya el medio completo normal por el medio de inducción (día 0).
3. Después de 48 h (día 2), reemplace el medio de inducción con el medio de mantenimiento.
4. Cambie el medio cada 3-5 días hasta que las células estén completamente diferenciadas.
   NOTA: Generalmente, después de 7-8 días de estimulación con el medio de inducción, las células se diferencian en células grasas maduras y se llenan de gotas de aceite que se pueden ver en los bordes de los adiposferoides.

4. Producción de medio condicionado para carcinoma de pulmón de Lewis (LLC-CM)

1. Siembra de células de carcinoma de pulmón de Lewis (LL/2) en placas de cultivo celular de 100 mm en medio de crecimiento a una densidad de 6000 células/^cm2.
   NOTA: El medio de crecimiento contiene el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
2. Después de 2 días, reemplace el medio en cada placa con medio de crecimiento fresco.
   NOTA: Las células LL/2 contienen una mezcla heterogénea de células adherentes (mayor número) y flotantes.
3. Después de 2 días (día 4), coseche el medio acondicionado y límpielo de células y residuos mediante centrifugación (500 × g, 10 min).
4. Congele las alícuotas del medio acondicionado en nitrógeno líquido para su uso posterior.
   NOTA: Para tratar los esferoides con el medio acondicionado, use una combinación de 75% de medio de crecimiento fresco y 25% de medio acondicionado LLC.

Resultados

Adiposferoides a partir de cultivo 3D de células de fracción vascular estromal (FSV)
Tanto los cultivos 3D como los 2D confluentes se configuraron con el mismo número de células SVF de la misma preparación WAT inguinal de ratón (Figura 1A, Figura 1B) y se sometieron al mismo protocolo experimental para comparar el marcador de expresión génica. Los esferoides estimulados con medio de inducción se expandieron co...

Discusión

Este protocolo establece un sistema de cultivo celular en 3D para estudiar la diferenciación de adipocitos en adiposferoides derivados de células SVF primarias de WAT. En comparación con el cultivo adherente 2D convencional, este sistema 3D facilita la remodelación de AT, que se asemeja mucho a las condiciones in vivo. En los últimos años, los estudios han demostrado que el cultivo de células en 3D produce una morfología y señalización celular distintas en comparación con un sistema de c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3-isobutil-1-metilxantina	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	I-5879 Kit de
bioimpresión de 96 pocillos	Greiner negro (Monroe, Carolina del Norte, EE. UU.)	655841	Cultivo celular
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragmento de burro Anti-Conejo IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Tinción de inmunofluorescencia, secundaria, 1:400 en TBS con 0.1% MICROPLACA DE CULTIVO CELULAR Tween-20
, 96 POCILLOS, PS, F-BOTTOM Y MICRO; TRANSPARENTE, NEGRO, CELLSTAR, SUPERFICIE REPELENTE A LOS CÉLULAS, TAPA, ESTÉRIL, 8 PIEZAS/BOLSA	Greiner (Monroe, Carolina del Norte, Estados Unidos)	655976	Cultivo celular
Dexametasona	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	D-1756	Cultivo celular
DMEM	Corning (Manassas, VA, EE. UU.)	10-017-CV	Cultivo celular
Suero fetal bovino (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cultivo celular
Indometacina	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	I-7378	Cultivo celular
Insulina	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	I0516	Cultivo celular
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.)	CRL-1642	Línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, Carolina del Norte, EE. UU.)	657843	Cultivo celular
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, EE. UU.)	R37606	Tinción por inmunofluorescencia, siguiendo las instrucciones del fabricante
Estreptococo	en pluma Corning (Manassas, VA, EE. UU.)	30-002-CI	Cultivo celular
Perilipina-1 (D1D8) XP	Tecnología de señalización de células mAb de conejo (Danvers, MA, EE. UU.)	9349	Tinción de inmunofluorescencia, primaria, 1:1000 en TBS con 0,1% Tween-20
Rosiglitazona	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	R-2408	Cultivo celular
Tripsina-EDTA, 0,05%	Corning (Manassas, VA, EE. UU.)	25-052-CI	Cultivo celular
transcripción inversa<> fuerte<
/fuerte>	Adelante	Reverso
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
em>Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTTTT	ACCCTTGCTCGCTCTTTGACT
em>Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
em>Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCTCTCTCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
em>Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
strong>Genotipado de ratón
Nombre del primer nombre	Descripción	Sequence
Cre F	Genérico Cre adelante	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Genérico Cre reverso	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG adelante	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG tipo salvaje reverso	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutante reverso	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutante hacia adelante	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutante reverso	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 tipo salvaje	adelante GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 tipo salvaje	reverso GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C