Evaluación de la reprogramación cardíaca mediante el análisis de imágenes de alto contenido

Summary

Presentamos un protocolo para cuantificar células similares a cardiomiocitos (iCMs) inducidas directamente reprogramadas in vitro utilizando análisis de imagen de alto contenido. Este método nos permite cuantificar la eficiencia de la reprogramación cardíaca de forma automatizada y visualizar directamente los iCMs.

Abstract

El objetivo de este protocolo es describir un método para cuantificar las células similares a cardiomiocitos (iCMs) inducidas, que son reprogramadas directamente in vitro mediante una técnica de reprogramación. La reprogramación cardíaca proporciona una estrategia para generar nuevos cardiomiocitos. Mediante la introducción de factores de transcripción cardiogénicos centrales en los fibroblastos; los fibroblastos se pueden convertir en iCM sin transición a través del estado de células madre pluripotentes. Sin embargo, la tasa de conversión de fibroblastos en iCMs sigue siendo baja. En consecuencia, ha habido numerosos enfoques adicionales para mejorar la eficiencia de la reprogramación cardíaca. La mayoría de estos estudios evaluaron la eficiencia de la reprogramación cardíaca mediante citometría de flujo, mientras que al mismo tiempo realizaron inmunocitoquímica para visualizar los iCM. Por lo tanto, se requieren al menos dos conjuntos separados de experimentos de reprogramación para demostrar el éxito de la reprogramación de iCM. Por el contrario, el análisis automatizado de imágenes de alto contenido proporcionará tanto la cuantificación como la calificación de la reprogramación de iCM con un número relativamente pequeño de células. Con este método, es posible evaluar directamente la cantidad y la calidad de los iCM con un solo experimento de reprogramación. Este enfoque podrá facilitar futuros estudios de reprogramación cardíaca que requieran experimentos de reprogramación a gran escala, como el cribado de factores genéticos o farmacológicos, para mejorar la eficiencia de la reprogramación. Además, la aplicación del protocolo de análisis de imágenes de alto contenido no se limita a la reprogramación cardíaca. Se puede aplicar a la reprogramación de otros linajes celulares, así como a cualquier experimento de inmunotinción que necesite tanto la cuantificación como la visualización de células inmunoteñidas.

Introduction

La reprogramación cardíaca se ha desarrollado como un enfoque alternativo a los enfoques mediados por células madre para generar nuevos cardiomiocitos. Dado que no pasa por el estado de células madre, tiene un alto potencial para eludir algunas limitaciones heredadas en los enfoques mediados por células madre. Se ha demostrado que la infección viral de al menos tres o cuatro factores de transcripción cardiogénicos en fibroblastos puede convertir los fibroblastos en un destino cardíaco mediante la eliminación de los programas genéticos de fibroblastos y la reconstrucción de las redes transcripcionales cardiogéni....

Protocol

Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt.

1. Generación de retrovirus y reprogramación cardíaca in vitro

1. Cultivo de células Platinum E en DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1 μg/mL de puromicina y 10 μg/mL de blasticidina hasta que la confluencia de células Platinum E alcance 70-80%.
2. El día 1, siembre ~0.55 x 10⁶ celdas (primer pocillo) y ~0.18 x 10⁶ celdas (segundo pocillo) en dos pocillos separados d....

Results

Después de los experimentos de reprogramación, cuantificamos los iCM utilizando el análisis de imágenes de alto contenido como se describió anteriormente. En la Figura 1 se mostraron imágenes compuestas de 36 sitios de imágenes que se utilizaron para el análisis de imágenes de alto contenido. Las iCMs se definen como células dobles positivas (α-actinina⁺Titina-eGFP⁺) en estos experimentos. El análisis de imágenes de alto contenido muestra que ~ 26% de las células exhibi.......

Discussion

Los estudios de reprogramación anteriores evaluaron la eficiencia de la reprogramación mediante citometría de flujo y demostraron la calidad estructural de los iCM mediante inmunocitoquímica en dos experimentos separados. El análisis de citometría de flujo requiere un número mucho mayor de células iniciales, lo que aumenta la escala de los experimentos. Por el contrario, el análisis de imágenes de alto contenido puede evaluar tanto la calidad como la cantidad de la reprogramación de iCM .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-pollo Alexa 488	Thermofisher	A11039
anticuerpo anti-GFP	Invitrogen	A10262
anti-ratón Alexa 555	Thermofisher	A21422
anticuerpo anti-&alfa;-actinina	Sigma	A7811
DAPI solución	Laboratorios vectoriales	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulina-Transferrina-SelenioSuplemento G	Invitrogen	41400-045
Medio 199	Invitrogen	11150059
MEM solución vitamínica	Invitrogen	11120-052
Software MetaXpress	Dispositivo
Micro XL sistema automatizado de imagen celular	Dispositivo
Solución mínima de aminoácidos esenciales	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
Filtro PES (0.45 & m)	Thomas scientific	1159T84
Células E de Platninum Cell	Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Tampón de bloqueo universal	BiogeneX	HK083-50K