Este protocolo presenta un método para utilizar dosimetría radical en línea y una fuente de luz plasmática para realizar la huella de proteínas de oxidación flash. Este método reemplaza el peligroso láser UV para simplificar y mejorar la reproducibilidad de la oxidación fotoquímica rápida de los estudios de proteínas.
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Artículo de método
Huella De Proteína De Radicales Hidroxilo Libre De Láser Para Realizar Análisis Estructurales De Orden Superior De Proteínas
En este artículo
Resumen
Resumen
La huella de proteína radical hidroxilo (HRPF) es una técnica de análisis estructural de orden superior emergente y prometedora que proporciona información sobre los cambios en la estructura de la proteína, las interacciones proteína-proteína o las interacciones proteína-ligando. HRPF utiliza radicales hidroxilo(▪OH) para etiquetar irreversiblemente la superficie accesible del disolvente de una proteína. La complejidad inherente, el costo y la naturaleza peligrosa de la realización de HRPF han limitado sustancialmente la adopción de base amplia en la biofarmacia. Estos factores incluyen: 1) el uso de láseres complicados, peligrosos y costosos que exigen precauciones de seguridad sustanciales; y 2) la irreproducibilidad de HRPF causada por el barrido del fondo de ▪OH que limitan estudios comparativos. Esta publicación proporciona un protocolo para el funcionamiento de un sistema HRPF libre de láser. Este sistema HRPF libre de láser utiliza una tecnología de oxidación flash de fuente de luz de plasma de alta energía y alta presión con dosimetría radical en línea. La fuente de luz plasmática es más segura, más fácil de usar y más eficiente en la generación de radicales hidroxilo que los sistemas HRPF basados en láser, y el dosímetro radical en línea aumenta la reproducibilidad de los estudios. Combinado, el sistema HRPF sin láser aborda y supera las deficiencias y limitaciones mencionadas de las técnicas basadas en láser.
Introducción
La conformación de las proteínas y la estructura de orden superior (HOS) asociada son los principales determinantes de la función biológica adecuada y el comportamiento aberrante1. Lo mismo se aplica a los productos biofarmacéuticos, cuya estructura y actividad funcional depende de diversos aspectos de su producción y entorno. El cambio biofarmacéutico en el SCA se ha relacionado con reacciones adversas a fármacos (ADR) atribuidas a la farmacología indeseable y a la respuesta inmunológica del paciente2,3. La aparición de los ADR ha alertado a la industria biofarmacéutica sobre el papel ....
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Protocolo
1. Instalación del tubo capilar
- Usando una piedra de hendidura de sílice, escinda capilar de sílice de 250 μm de diámetro interior (ID) a 27 pulgadas. Revise los extremos capilares para un corte limpio y recto.
- Cree dos ventanas de aproximadamente 15 mm de longitud quemando el recubrimiento de poliimida. A partir del "extremo inferior" hacer la primera ventana de fotólisis 90 mm de distancia del "extremo inferior" y la segunda ventana del dosímetro 225 mm de distancia del "extremo inferior".
NOTA: Una vez que el recubrimiento se quema, el capilar es muy frágil. - Desenrosque la tuerca y la férula en el puerto 5 e inserte el "extremo infe....
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Resultados
La fuente de plasma de alta presión junto con la dosimetría en tiempo real permite un mejor control de ▪rendimiento de OH para observar los cambios en la estructura de proteínas de orden superior con mayor precisión. La adición de adenina permite un dosímetro radical eficaz en tiempo real. Tras la oxidación, la adenina pierde absorbancia UV a 265 nm(Figura 2A). El cambio en la absorbancia de la adenina está directamente relacionado con la concentración de radicales disponibles par.......
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Discusión
Hay varios pasos críticos para asegurar el etiquetado adecuado de las proteínas durante cualquier experimento hrpf. En primer lugar, se selecciona un caudal adecuado y un tipo de inflamación de la fuente para asegurarse de que cada bolo de la muestra se irradia una vez. Esto asegura que la proteína se expone a un solo bolo de ▪oh recién formado. Una vez que una proteína se oxida, la estructura de la proteína de orden superior puede ser alterada. Para estar seguro de que la estructura de la proteína nativa es s.......
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Divulgaciones
E.E.C., J.S.S., y S.R.W. revelan un interés financiero significativo en GenNext Technologies, Inc., una compañía en etapa temprana que busca comercializar tecnologías para el análisis de la estructura de proteínas de orden superior. Los datos representativos proporcionados han sido revisados por S.K.M., que no tiene ningún conflicto de intereses financieros.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (R43GM125420 y R44GM125420).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | cualquier marca es suficiente |
| 50 µ L SGE Jeringas herméticas al gas | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumna (0,75 mm X 150 mm, 2 y micro; m) | Acetonitrilo Thermo Scientific | ||
| con 0,1% de ácido fórmico (v/v), grado LC/MS | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomioglobina | Sigma-Aldrich | ||
| Catalasa | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 022625501 | |
| Limpiaparabrisas para tareas delicadas | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Peróxido de hidrógeno | Fisher Scientific | H325-100 | cualquier peróxido de hidrógeno al 30% es suficiente |
| Amida de metionina | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrífuga | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Espectrómetro de masas tríbrido | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos | se pueden utilizar otros instrumentos de alta resolución (por ejemplo, Q exactive Orbitrap o Orbitrap Fusion) |
| Pierce Tripsina Proteasa, Grado MS Thermo | Scientific | 90058 | |
| Polymicro Piedra de hendidura, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | cualquier cortador de tubos capilares es suficiente |
| Agua UPLC | Thermo Scientific | ||
| con 0,1% de ácido fórmico (v/v), grado LC/MS | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| agua, grado LC/MS | Fisher Scientific | W6-4 |
Referencias
- Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
- Giezen, T. J., Schneider, C. K.
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Reimpresiones y permisos
