Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.
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Artículo de método
Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células olfativas ensheathing glia (OEG) se localizan desde la mucosa olfativa hasta la capa nerviosa olfativa (ONL) de la bombilla olfativa. A lo largo de la vida adulta, son clave para el cultivo axonal de neuronas olfativas recién generadas, desde la lamina propria hasta la ONL. Debido a sus propiedades pro-regenerativas, estas células se han utilizado para fomentar la regeneración axonal en modelos de lesión de la médula espinal o del nervio óptico.
Presentamos un modelo in vitro para adormecer y medir la capacidad neurorregenerativa de OEG después de una lesión neuronal. En este modelo, el OEG humano increíblemente inmortalizado (ihOEG) se cultiva como una monocapa, las retinas se extraen de ratas adultas y las neuronas ganglionas retinianas (RGN) se coculan en la monocapa OEG. Después de las 96 h, los marcadores axonal y somatodendritico en RGNs son analizados por inmunofluorescencia y se cuantifica el número de RGNs con axón y la longitud/neurona axonal media.
Este protocolo tiene la ventaja sobre otros ensayos in vitro que se basan en neuronas embrionarias o postnatal, que evalúa las propiedades neurorregenerativas OEG en el tejido adulto. Además, no sólo es útil para evaluar el potencial neurorregenerativo de ihOEG, pero se puede extender a diferentes fuentes de OEG u otras células gliales.
Introducción
Las neuronas del sistema nervioso central adulto (SNC) tienen una capacidad regenerativa limitada después de una lesión o enfermedad. Una estrategia común para promover la regeneración del SNC es el trasplante, en el sitio de lesiones, de tipos celulares que inducen el crecimiento axonal como células madre, células Schwann, astrocitos o células olfativas de glia (OEG)1,2,3,4,5.
OEG deriva de la cresta neural6 y se encuentra en la mucosa olfativa y....
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Protocolo
NOTA: La experimentación con animales fue aprobada por comités nacionales e institucionales de bioética.
1. ihOEG (Ts12 y Ts14) cultura
NOTA: Este procedimiento se realiza en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de cultivo de tejidos.
- Preparar 50 mL ME10 Medio de cultivo OEG según lo dispuesto en el Cuadro 1.
- Preparar 5 ml de DMEM/F12-FBS, según lo dispuesto en el Cuadro 1,en un tubo cónico de 15 ml.
- Caliente ambos medios a 37 °C en un baño de agua limpia, durante 15 minutos.
- Descongelar viales de células Ts12 y Ts14 a 37 °C....
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Resultados
En este protocolo, presentamos un modelo in vitro para augur la capacidad neurorregenerativa OEG después de una lesión neuronal. Como se muestra en la Figura 1,la fuente OEG es una línea celular clonal OEG humana inmortalizada reversible -Ts14 y Ts12-, que deriva de cultivos primarios, preparados a partir de bombillas olfativas obtenidas en autopsias15,17,18. El tejido retiniano se extrae de ratas a.......
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Discusión
El trasplante de OEG en los sitios de lesiones del SNC se considera una terapia prometedora para la lesión del SNC debido a sus propiedades pro-neurorregenerativas constitutivas7,8,9. Sin embargo, dependiendo de la fuente de tejido —mucosa olfativa (OM-OEG) frente a bulbo olfativo (OB-OEG)— o la edad del donante, existe una variación considerable en dicha capacidad26,31,.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo financiero del proyecto SAF2017-82736-C2-1-R del Ministerio de Ciencia e Innovación a MTM-F y de la Fundación Universidad Francisco de Vitoria a JS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| anticuerpo 514 | Referencia 34 | Antisuero policlonal de conejo, que reconoce MAP2A y B. | |
| anticuerpo SMI-31 | BioLegend | 801601 | Anticuerpo monoclonal contra las proteínas MAP1B y NF-H |
| anti-ratón Anticuerpo Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-conejo Alexa Anticuerpo Fluor 594 | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Suplemento | Gibco | 17504044 | |
| ácido D,L-2-amino-5-fosfonovalérico | Sigma | 283967 | Inhibidor del receptor NMDA |
| DAPI | Sigma | D9542 | Núcleos tinción fluorescente |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | medio de cultivo celular |
| FBS | Gibco 11573397 | Suero fetal bovino | |
| FBS-Hyclone Fisher | 16291082 | Suero fetal bovino | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Medio de montaje |
| ImageJ | Institutos Nacionales de Salud (NIH-USA) | Software de imagen | |
| L-glutamina | Lonza | BE17-605F | |
| Medio neurobasal | Gibco | 21103049 | Medio de cultivo de células neuronales |
| Sistema de disociación de papaína | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Para uso en el aislamiento de células neuronales |
| PBS | Hecho en casa | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicilina/Estreptomicina/Anfotericina B | Lonza | 17-745E | Bacteriostático y bactericida |
| Extracto de hipófisis | Gibco | 13028014 | Bovino Extracto de hipófisis |
| Poli -L-lisina (PLL) | Sigma | A-003-M |
Referencias
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W.
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Reimpresiones y permisos
