Artículo de método

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

4.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/61870

⸱

28 de mayo de 2021

 ,  ,  , 
1Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

En este artículo

Resumen

La microscopia estimulada de la dispersión de Raman (SRS) permite la proyección de imagen selectiva, etiqueta-libre de mitades químicas específicas y se ha empleado con eficacia para las moléculas del lípido de la imagen in vivo. Aquí, proporcionamos una breve introducción al principio de la microscopía SRS y describimos métodos para su uso en el almacenamiento de lípidos por imágenes en Caenorhabditis elegans.

Resumen

El metabolismo lipídico es un proceso fisiológico fundamental necesario para la salud celular y del organismo. La desregulación del metabolismo lipídico a menudo provoca obesidad y muchas enfermedades asociadas, incluidos los trastornos cardiovasculares, la diabetes tipo II y el cáncer. Para avanzar en la comprensión actual de la regulación metabólica lipídica, los métodos cuantitativos para medir con precisión los niveles de almacenamiento de lípidos in vivo en el tiempo y el espacio se han vuelto cada vez más importantes y útiles. Los enfoques tradicionales para analizar el almacenamiento de lípidos son semicuantita cuantitativos para la evaluación microscópica o carecen de información espacio-temporal para la medición bioquímica. La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imágenes químicas sin etiquetas que permite la detección rápida y cuantitativa de lípidos en células vivas con una resolución subcelular. Como el contraste se explota a partir de vibraciones moleculares intrínsecas, la microscopía SRS también permite el seguimiento cuatridimensional de lípidos en animales vivos. En la última década, la microscopía SRS ha sido ampliamente utilizada para imágenes de moléculas pequeñas en la investigación biomédica y superar las principales limitaciones de los métodos convencionales de tinción fluorescente y extracción de lípidos. En el laboratorio, hemos combinado la microscopía SRS con las herramientas genéticas y bioquímicas disponibles para el poderoso organismo modelo, Caenorhabditis elegans, para investigar la distribución y heterogeneidad de las gotitas de lípidos a través de diferentes células y tejidos y, en última instancia, para descubrir nuevas vías de señalización conservadas que modulan el metabolismo lipídico. Aquí, presentamos los principios de trabajo y la configuración detallada del microscopio SRS y proporcionar métodos para su uso en la cuantificación del almacenamiento de lípidos en distintos puntos de tiempo de desarrollo de tipo salvaje y la señalización de insulina deficiente mutante C. elegans.

Introducción

La obesidad se ha convertido en un problema de salud global que amenaza a un tercio de la población en todo el mundo, y presenta una grave preocupación médica, dada su asociación con la mala salud mental1 y enfermedades mortales como la diabetes2,las enfermedades cardiovasculares3 y algunos tipos de cáncer4. El estudio del metabolismo lipídico es esencial para comprender mejor los problemas biológicos detrás de la obesidad. La cuantificación rápida y específica del almacenamiento lipídico conlleva la detección de ácidos grasos y sus derivados, así como de metabolitos que contienen esteroles, con alta sensibilidad y preferiblemente con información espacial. Los lípidos son objetivos desafiantes para la imagen porque carecen de fluorescencia intrínseca y no se pueden etiquetar fácilmente fluorescentemente. Las etiquetas fluorescentes son a menudo más grandes que las moléculas lipídicas y, por lo tanto, pueden ser químicamente invasivas y poco prácticas para aplicaciones in vivo. La estrategia de etiquetado sin etiquetas o mínima es necesaria para preservar la estructura hidrofóbica de las moléculas lipídicas5. Los desarrollos recientes en tecnologías de la proyección de imagen han creado las oportunidades emocionantes para la proyección de imagen etiqueta-libre de lípidos en células, tejidos, y organismos vivos.

Los enfoques tradicionales para los análisis de almacenamiento de lípidos en muestras biológicas incluyen ensayos bioquímicos y protocolos de tinción con tintes lipofílicos. Los ensayos de cuantificación bioquímica que involucran espectrometría de masas (EM) son incomparables en su resolubilidad molecular, pero requieren cantidades de muestra muy grandes y la preparación de la muestra generalmente toma varias horas, lo que limita su aplicación para imágenes en tiempo real de sistemas vivos5. Otra limitación importante de estos ensayos es la falta de información espacial. Por otro lado, los tintes lipofílicos como Oil Red O y Sudan Black proporcionan distribución tisular y celular de orgánulos de almacenamiento de lípidos y, en comparación con las técnicas de EM, estos métodos de tinción también son de bajo costo y fáciles de realizar. Sin embargo, estos protocolos de tinción requieren fijación, lo que puede impactar la naturaleza hidrofóbica de las gotitas lipídicas, generar cambios artificiales en su estructura y resultar en inconsistencias entre experimentos6. Las dificultades técnicas asociadas a técnicas bioquímicas y de coloración han llevado a la búsqueda para los métodos etiqueta-libres para las moléculas del lípido de la imagen y al aumento rápido en el uso de la microscopia coherente de la dispersión de Raman (CRS) en proyección de imagen del lípido.

El efecto Raman fue reconocido por primera vez por Raman y Krishnan, donde informaron que al interactuar con un fotón, una molécula puede generar luz dispersa sin cambio en la longitud de onda (llamada dispersión de Rayleigh) o rara vez con una longitud de onda alterada (llamada dispersión Raman) y este cambio en la longitud de onda es característico de los grupos químicos funcionales dentro de la molécula7. Cuando los enlaces químicos dentro de una molécula se excitan a un nivel de energía vibracional más alto por un fotón incidente, llamado fotón de bomba, la energía del fotón disperso, llamado fotón de Stokes, se vuelve más baja. De lo contrario, los enlaces químicos pueden alcanzar un nivel de energía vibracional más bajo si originalmente están en un nivel más alto, y el fotón disperso gana energía para ser el fotón anti-Stokes. La diferencia de frecuencia entre los fotones incidentes y dispersos se conoce como el cambio Raman. Cada enlace químico dentro de una molécula tiene un cambio Raman característico y cuantificable. Por ejemplo, el enlaceCH2 tiene un desplazamiento Raman de 2.845 cm-1,que es abundante en cadenas de ácidos grasos8. Esta señal raman espontánea es generalmente muy débil, lo que ha limitado enormemente la velocidad de la proyección de imagen en microscopia raman espontánea convencional. A lo largo de los años, se han desarrollado varios enfoques para aumentar la velocidad de imagen y la sensibilidad de la microscopía Raman espontánea. La microscopía de dispersión Raman coherente, incluida la microscopía de dispersión Raman coherente anti-Stokes (CARS) y la microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS), es el progreso más reciente. CARS y SRS tienen principios de trabajo ligeramente diferentes, pero ambas son técnicas sin etiquetas que tienen capacidad de imágenes en vivo, pueden producir información espacial y temporal sobre la dinámica de almacenamiento de lípidos y solo requieren un tamaño de muestra pequeño. La microscopía CARS sufre de fondo no resonante, que proviene de varios procesos no lineales, y las señales CARS también tienen relación no lineal con la concentración de la molécula, lo que en conjunto complica el proceso de cuantificación9. A diferencia de la microscopía CARS, la microscopía SRS no genera señales de fondo no resonantes y ofrece una dependencia lineal de la concentración de la molécula de interés. Por lo tanto, actualmente la microscopía SRS es más ampliamente utilizada para la obtención de imágenes lipídicas.

En microscopía SRS, las señales Raman espontáneas débiles se pueden amplificar cuando están excitadas por dos rayos láser sincronizados con su diferencia de frecuencia que coincide con la frecuencia vibracional del enlace químico. La molécula experimentará una transición mejorada a un estado excitado debido a la excitación coherente. Como resultado, se aumenta la tasa de generación de fotones de Stokes. En consecuencia, la intensidad del haz "Stokes" transmitido aumenta (ganancia Raman estimulada, SRG) y la intensidad del haz de "bomba" transmitida disminuye (pérdida Raman estimulada, SRL). La detección de señales SRG o SRL subyace a la base para la obtención de imágenes de microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) de moléculas con enlaces químicos específicos10. Si la diferencia de frecuencia entre los dos rayos láser no coincide con la frecuencia vibracional del enlace químico dentro de una molécula de interés, no se generarán señales SRG ni SRL. La velocidad de imagen de la microscopía SRS es de alrededor de 2 μsec por píxel o 1 segundo por fotograma, que es mucho más rápido que la microscopía Raman espontánea11. La resolución lateral típica para la microscopía SRS es difracción limitada y alrededor de 300 nm. Además, los procesos ópticos de dos fotones de la microscopía SRS permiten obtener imágenes volumétricas en 3D de muestras de tejido relativamente gruesas y la profundidad de la imagen podría alcanzar los 300-500 μm. En general, la microscopía SRS presenta una técnica de imagen eficiente y sin etiquetas para detectar biomoléculas específicas, especialmente lípidos.

Las gotitas de lípidos son orgánulos de una sola membrana, que son el principal sitio de almacenamiento celular para lípidos neutros, incluidos los triacilglicerols (TAGs) y los ésteres de colesterol (CE). Losenlaces CH2 en las cadenas de ácidos grasos de estas moléculas lipídicas generan fuertes señales de SRS a 2.845 cm-1 cuando seexcitan 8,permitiendo así la detección y cuantificación de los niveles de lípidos de almacenamiento en células intactas, secciones de tejidos e incluso organismos enteros12,13,14,15. Particularmente, los elegans de la C. son útiles para los estudios de la proyección de imagen del lípido debido a su transparencia. Al igual que los mamíferos, C. elegans también almacena lípidos en gotitas lipídicas y las vías de síntesis y degradación de las moléculas lipídicas están altamente conservadas16. En este protocolo, proporcionaremos el principio de funcionamiento de la microscopia SRS, su configuración fundamental y describiremos los métodos para su uso en imágenes lipídicas en C. elegans.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Configuración instrumental para la microscopía de dispersión Raman estimulada

NOTA: El sistema de microscopía SRS se basa en un láser de picosegundos con oscilador paramétrico óptico integrado en la bomba y un microscopio de barrido láser confocal. El oscilador proporciona dos trenes de impulsos de picosegundos, incluyendo un haz de Stokes a 1.064 nm y un haz de bomba sintonizable entre 700-990 nm. La superposición temporal y espacial de los dos haces se logra dentro del láser. Un modulador electroóptico (EOM) incorporado está diseñado específicamente para microscopía SRS. Este protocolo se centrará en el acoplamiento del láser con el microscopio, y el funcionamiento diario de este sistema (Figura 1). La configuración de un sistema de microscopio SRS está evolucionando en la última década. Cabe señalar que la siguiente descripción sólo representa una de las varias configuraciones.

  1. Alimentación de rayos láser en el microscopio
    1. Configure el periscopio para levantar el haz desde la salida de la fuente de luz de picosegundos hasta el puerto de entrada láser IR en el escáner del microscopio.
      PRECAUCIÓN: Lea el manual del sistema láser antes de la operación y tome todas las precauciones necesarias porque la radiación infrarroja cercana generada por este sistema láser de Clase IV puede causar daños graves a los ojos y la piel. Completar las capacitaciones que son requeridas por los departamentos institucionales de seguridad ambiental. Use gafas protectoras y bata de laboratorio con mangas con puños.
    2. En primer lugar, establezca el haz de la bomba en 750 nm y baje la potencia del láser a 50 mW, que se puede inspeccionar visualmente, afiliando la alineación. A continuación, utilice un expansor de haz(Figura 1,L1 y L2) para ajustar el diámetro del haz para que se ajuste a la apertura posterior de los objetivos del microscopio. Utilice dos espejos de relé(Figura 1,M1 y M2) para guiar el rayo láser al periscopio(Figura 1,P1 y P2). El periscopio levantará el haz a la altura de la abertura del escáner y servirá como espejo de dirección para la alineación también.
    3. Ajuste las perillas del periscopio en el centro del rango de ajuste y elija la posición inicial y el ángulo de cada espejo de tal manera que el rayo láser golpee el centro del espejo, aproximadamente.
    4. Realice la alineación gruesa usando un puerto vacío en la torreta objetivo y coloque la sonda del medidor de potencia para medir la potencia de la luz transmitida. Configure el escáner del microscopio con el zoom más alto (50x) y, a continuación, mida la potencia de la luz transmitida con el punto de rayo láser enfocado. Optimice los mandos de cada espejo, M1 y M2, de forma iterativa para lograr la mayor potencia láser transmitida.
    5. Realice la alineación fina con la herramienta de alineación. Coloque la tapa de alineación del objetivo de fluorescencia en el asiento objetivo vacío y ajuste las perillas de M1 para centrar el punto. Luego, introduzca el tubo de extensión para el objetivo y afina las perillas de M2 para centrar el punto.
    6. Repita los pasos 1.1.4 y 1.1.5 hasta que el haz pídanos el objetivo en ambas posiciones.
  2. Conexión de detección y electrónica
    1. Configure el módulo de detección de SRS. Coloque un cuber divisor de haz después del condensador para dirigir el láser transmitido al módulo de fotodiodo. El módulo incluye un telescopio para retransmitir y cambiar el tamaño del haz para que se ajuste al área activa del fotodiodo, así como un filtro óptico para eliminar el haz modulado de Stokes y dejar que el haz de la bomba pase para la demodulación.
    2. Configurar la conexión electrónica (Figura 1). La intensidad del haz de Stokes es modulada por una PROA incorporada a 20 MHz dentro del láser sintonizable de picosegundos. La salida de frecuencia de modulación del láser se introduce en el amplificador de bloqueo como la frecuencia de referencia para la demodulación. Alimente la señal de salida del fotodiodo en el amplificador de bloqueo para demodular el SRL.
      NOTA: Los sistemas láser de una sola caja se pueden actualizar y, por lo tanto, sus especificaciones pueden variar debido a la diferente fecha de producción. La versión anterior del sistema láser sintonizable de picosegundos, utilizado en este protocolo, tiene un haz de Stokes de 1.064 nm, pero la versión reciente tiene un haz de Stokes de 1.031 nm. La frecuencia de modulación de la EOM utilizada en este protocolo se personaliza a 8 MHz, pero la frecuencia de modulación predeterminada para el sistema reciente puede ser de 10 o 20 MHz.
    3. Finalmente, alimente la salida del amplificador de bloqueo en la caja analógica del microscopio para convertir la señal analógica eléctrica en señal digital. El sistema debe estar listo para procesar la señal SRS.
  3. Optimizar las condiciones de obtención de imágenes
    1. Haga una muestra química para la alineación del sistema. Por ejemplo, utilice dodecano para optimizar el microscopio, porque el dodecano tiene una señal SRS muy fuerte de los enlaces C-H. Utilice un sello seguro para hacer una minicámara; poner 5 μL de dodecano y cubrirlo con un cubrebocas.
      NOTA: Reemplace la muestra de dodecano una vez que parezca poco clara o presente desechos, con una nueva muestra que podría usarse para la alineación durante 2-3 meses.
    2. Coloque la muestra en la etapa del microscopio. Concéntrese adecuadamente en la gota de líquido. Se puede hacer más rápido buscando el borde de la almohadilla de dodecano. Ajuste el condensador para la iluminación Kohler.
    3. Establezca los parámetros de imagen. Compruebe si la etapa de retraso está en los números correctos. Establezca la longitud de onda del haz de la bomba en 795,8 nm. Utilizando una tarjeta de sensor IR y un visor IR, compruebe si la ruta del haz de la bomba sigue siendo correcta.
    4. Establezca la potencia del haz de la bomba en 200 mW y el haz de Stokes en 400 mW en el panel de control del sistema de picosegundos.
      NOTA: Los rendimientos del láser desde la salida del láser hasta el objetivo posterior de los dos haces son aproximadamente del 25% para la bomba y el 14% para Stokes para esta configuración del sistema. Por lo tanto, una potencia de objetivo posterior de la viga de la bomba es de aproximadamente 50 mW y para la viga de Stokes es de alrededor de 56 mW. El ancho de pulso del reciente sistema láser de picosegundos ha cambiado de 6 ps a 2 ps, por lo tanto, la potencia del láser aplicada debería ser aún menor.
    5. Establezca la ganancia del amplificador de bloqueo al máximo. Abra el obturador tanto para los haces, así como el obturador principal del láser.
    6. Escanee la muestra y compruebe la imagen en la pantalla del ordenador. Cambie el modo de visualización a Hi-Lo en el software de imágenes. Ajuste el rango para ver una saturación de ~ 50%. Compruebe si la saturación está centrada en la imagen. Si no es así, ajuste cuidadosamente los espejos retrovisores de dirección, M1 y M2, para maximizar la intensidad de la imagen y centrar la intensidad máxima.
    7. Afina la etapa de retardo y encuentra la intensidad máxima de la señal SRS de la muestra de dodecano. El sistema está listo para su uso.

2. Preparación de muestras de C. elegans para imágenes de microscopía SRS

NOTA: Como organismos modelo, Caenorhabditis elegans han demostrado ser muy útiles para múltiples técnicas de imagen. Son transparentes de cuerpo entero, por lo tanto, se pueden obtener imágenes de varios tejidos en el animal intacto sin necesidad de disección. En C. elegans, los lípidos neutros se almacenan en gotitas lipídicas localizadas en el intestino, que consiste en 20 células epiteliales ubicadas bisimétricamente alrededor de la luz intestinal16. Las células hipodérmicas y los ovocitos también almacenan lípidos. La principal forma de almacenamiento de lípidos en las gotitas lipídicas de C. elegans son los triacilglicerols (TAGs)17,que generan fuertes señales de SRS debido a la abundancia de enlacesCH2 presentes en sus cadenas de ácidos grasos. Esta sección se centrará en cómo preparar muestras de C. elegans para imágenes de microscopía SRS y cuantificación de sus niveles totales de almacenamiento de lípidos intestinales.

  1. Preparación de las diapositivas de imágenes
    1. Primero, prepare una solución de agarosa al 2% enH2O destilado, y asegúrese de que toda la agarosa se derrita antes de preparar las almohadillas de agarosa.
    2. Agregue una gota de agarosa caliente al 2% en un portaobjetos en blanco (aproximadamente 100 μL) que se coloca entre los portaobjetos de soporte con dos capas de cinta de laboratorio y coloque rápidamente un segundo portaobjetos encima del primer portaobjetos. Presione suavemente para crear una almohadilla delgada, incluso de agarosa.
    3. Deje estas guías a un lado en posición cerrada y no las separe hasta que los gusanos estén listos para ser montados. Prepare diapositivas frescas antes de cada sesión de imágenes, ya que las almohadillas se secarán después de 1 día.
      NOTA: Utilice cámaras de imágenes de múltiples pozos, si toma imágenes de varios gusanos en pantallas genéticas de alto rendimiento18. Utilice configuraciones de imágenes en vivo para obtener imágenes de la dinámica espacio-temporal del metabolismo lipídico a través del desarrollo y el envejecimiento19.
  2. Montaje de los gusanos
    1. Preparar el agente anestesiante añadiendo azida de sodio o levamisol en tampón M9 a la concentración final de 100 mM o 1 mM, respectivamente.
      NOTA: Use levamisol si los gusanos necesitan ser recuperados después de la toma de imágenes para el genotipado después de las pruebas genéticas.
      PRECAUCIÓN: Varios agentes anestesiantes, incluyendo azida de sodio y levamisol, son dañinos si se inhalan. Use guantes y ropa de protección, así como una campana de humos químicos al preparar esas soluciones de trabajo.
    2. Coloque una gota de agente anestesiante en un cubrebocas (aproximadamente 4–5 μL para 10–20 gusanos).
      NOTA: Ajuste la cantidad del agente anestesiante según el número de gusano para mantener los gusanos lo más cerca posible entre sí. El uso de demasiado líquido para pocos gusanos puede hacer que los gusanos se propaguen en la almohadilla de agarosa.
    3. Recoja los gusanos que se visualizarán bajo la microscopía de disección y transfiéralos a la gotita del agente anestesiante. Después de que todos los gusanos se agregan a la gota, muévalos usando el selector de gusanos y asegúrese de que no se superpongan entre sí.
    4. Separe los portaobjetos de vidrio (del paso 2.1) sin perturbar la almohadilla de agarosa.
    5. Cubra la gota de gusano con el portaobjetos de vidrio que tiene la almohadilla de agarosa. Asegúrese de que la almohadilla de agarosa esté orientada hacia los gusanos. Alternativamente, la gotita de envejecimiento anestesiante también se puede agregar a la almohadilla de agarosa y los gusanos se pueden cubrir con el cubrebocas.
    6. Finalmente, marque la ubicación de los gusanos usando un marcador permanente en el portaobjetos de vidrio.

3. Adquisición y análisis de imágenes

  1. Adquisición de las imágenes mediante el sistema de microscopio SRS.
    1. Antes de tomar imágenes de cualquier muestra, determine los parámetros de imagen y verifique las señales srs (como se explica en el protocolo 1).
    2. Monte la diapositiva con la tapa hacia la lente objetivo. Encienda la fuente de luz de campo brillante y dirigídala al ocular para localizar los gusanos.
      NOTA: Utilice una lente objetiva 20x para obtener imágenes del almacenamiento de lípidos en todo el intestino. Considere el uso de una lente objetiva 60x para obtener imágenes del almacenamiento de grasa hipodérmica o para cuantificar el tamaño / número de gotas de lípidos.
    3. Enfoque los gusanos y ajuste la posición del condensador en consecuencia.
    4. Apague la fuente de luz de campo brillante y cambie a la unidad de escaneo láser. Comience a escanear el primer gusano a una velocidad de escaneo rápida (por ejemplo, 512 x 512 píxeles) y ajuste el enfoque fino para encontrar el área de interés. Para que se muestre la primera muestra, ajuste las potencias del láser al nivel en el que las señales SRS no estén saturadas.
    5. Cambie a una velocidad de escaneo más lenta (por ejemplo, 2 μs/píxel) y una resolución más alta (por ejemplo, 1024 x 1024 píxeles) para obtener la imagen SRS.
      NOTA: Mantenga las potencias láser constantes para cada muestra que se va a tomar una imagen durante la sesión de imágenes.
    6. Guarde la imagen SRS en el formato deseado que permita una alta resolución (como un archivo .tiff). Dependiendo del software de imágenes y la configuración utilizada, guarde la ubicación del primer gusano antes de pasar al siguiente.
    7. Imágenes completas de todos los gusanos que se montaron en la diapositiva. Apague el obturador para bloquear los rayos láser. No apague la fuente láser hasta que se muestren imágenes de todas las muestras.
    8. Quite la diapositiva antes de colocar la siguiente diapositiva de muestra. Repita los pasos 3.1.2–3.1.7.
    9. Una vez que todas las muestras han sido fotovidas, ponga la fuente láser en espera y apague el equipo asociado, incluyendo el amplificador, el detector, el microscopio y la computadora.
  2. Análisis de imágenes utilizando ImageJ
    1. Abra los archivos de imagen (normalmente .tiff) para ser cuantificados en ImageJ, seleccionando los archivos y arrastrándolos y soltándolos en la ventana de ImageJ. Descargue los plug-ins ImageJ apropiados, si utiliza formatos de microscopio Olympus específicos (como archivos .oib).
    2. Seleccione las propiedades que se van a analizar (Analizar > Definir medidas). Para la cuantificación total del almacenamiento de lípidos, seleccione Área, Valor de gris mínimo y máximo y Valor de gris medio.
    3. Utilice la herramienta de selección de polígonos y delinee la región del intestino del gusano que se va a cuantificar. Para medir los parámetros seleccionados en el paso 3.2.2, haga clic en Analizar > Medir. Aparecerá una nueva ventana con los resultados de la medición. Repita este paso para todas las imágenes abiertas.
    4. Seleccione las mediciones de todos los gusanos de un genotipo determinado y copie/pegue los resultados en una nueva hoja de cálculo. Repita los pasos 3.2.1–3.2.4 para todos los genotipos de la misma sesión de diagnóstico por imágenes.
    5. Seleccione un área en las proximidades del gusano que no tiene ninguna señal SRS, para cuantificar como fondo. Asegúrese de que el área seleccionada para la medición de fondo no contenga ninguna bacteria o residuo que también pueda dar una señal de SRS.
    6. Reste el valor gris medio de fondo de las mediciones de cada gusano individual. Calcule el promedio y la desviación estándar de los valores grises medios restados de fondo de todos los gusanos en un grupo de genotipo/prueba dado. Normalice este valor al promedio del grupo de control.
    7. Finalmente, realice el análisis estadístico apropiado utilizando el valor medio de gris como medida para los niveles de lípidos en cada gusano. Normalmente, utilice la prueba tde Student para dos grupos y utilice ANOVA unidireccional con una prueba de comparación múltiple adecuada para más de dos grupos.
      NOTA: Al seleccionar imágenes para la presentación de la figura, asegúrese de que las imágenes seleccionadas tengan la misma distribución de intensidad de píxeles. Establezca el brillo y el contraste en los mismos valores para todas las imágenes de la misma figura (Imagen > Ajustar > Brillo y contraste).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La señalización de la insulina es un camino endocrino importante que afecta el desarrollo, la reproducción, la vida útil, y el metabolismo. En los gusanos, la señalización de insulina consiste en aproximadamente 40 ligandos peptídicos similares a la insulina, ortólogos daf-2 del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, cascada de quinasa PI3K/AKT aguas abajo y el ortólogo del factor de transcripción FoxO, DAF-1620. los mutantes daf-2, que carecen del receptor de insulina,...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

En defensa contra la obesidad y sus trastornos metabólicos asociados, se han implementado importantes esfuerzos de investigación para comprender mejor los mecanismos reguladores de la homeostasis lipídica. Para la detección cuantitativa de moléculas del lípido en muestras biológicas, la proyección de imagen etiqueta-libre por microscopia del SRS se ha demostrado para ser una alternativa confiable a los análisis bioquímicos y a otros métodos de coloración. Nuestro grupo y otros han revelado nuevos mecanismos biológicos en...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), y por el investigador del HHMI (M.C.W.). Agradecemos al Caenorhabditis Genetics Center (CGC) por las cepas de C. elegans.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Convertidor A/DanalógicaOlympus
AgaroseGeneMate3119Para la fabricación de almohadillas de agarosa
Herramienta de alineación - adaptadorThorlabsSM1A4Para montar la herramienta en el visor
Herramienta de alineación - objetivoThorlabsVRC2SM1Para la visualización de láser IR
Herramienta de alineación - tuboThorlabsSM1L40Longitud de la lata variar
Autocorrelador (Opcional)Pulso APECheck
Filtro de paso de bandaminicircuitosBBP-21.4+ si se modula a 20MHz o KR Electronics 2724 si se modula a 8 MHzPara señal con modulación Filtrado de frecuencia Cables
BNC
Microscopio de disecciónNikonSMZ800Para la manipulación y selección de gusanos para la obtención de imágenes
DodecanoSigma-Aldrich44010Se utiliza para la calibración de la señal SRS
FiltroTecnología Chroma890/220 CARSPara la extracción del haz de Stokes
Cinta de etiquetado de laboratorio de uso generalVWR89097Para la fabricación de almohadillas de agarosa
Cubreobjetos de vidrioVWR48393-106Para cubrir gusanos para la adquisición de imágenes
Portaobjetos de microscopio de vidrioVWR16004-422Para la fabricación de almohadillas de agarosa
Microscopio de barrido láserOlympusFV3000
LenteThorlabsL1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		Para expansor de haz
Amplificador de bloqueoZurichHF2LI
Minicircuitos de filtro depaso bajoBLP-1.9+Para la supresión de ruido de la fuente
de alimentación EspejosThorlabsBB1-E03Para relé y periscopio
ObjetivoOlympusUPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
FotodiodoThorlabsFDS1010
picosegundosAPEpicoEmerald
Fuente de alimentaciónTEKPOWERTP1342UPara fotodiodo, voltaje invertido de 50V
Azida de sodioSigmaS2002Para anestesiar los gusanos
Recogedor de gusanosWormStuff59-AWP
Unidad Fuente láser de

Referencias

  1. Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
  2. Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
  3. Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
  4. Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
  5. Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
  6. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  7. Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
  8. Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
  9. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
  10. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  11. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  12. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  13. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  14. Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
  15. Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31(2015).
  16. Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
  17. Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
  18. Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865(2017).
  19. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
  20. Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
  21. Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
  22. Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
  23. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
  24. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  25. Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
  26. Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
  27. Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450(2020).
  28. Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
  29. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  30. Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
  31. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  32. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
  33. Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
  34. Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
  35. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  36. Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
  37. Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
  38. Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
  39. Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930(2015).
  40. Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
  41. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  42. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  43. Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Cuantificaci n de gotas lip dicasConfiguraci n de microscop a SRSMutantes de se alizaci n de la insulinaAn lisis de isoformas de Daf 16Regulaci n del metabolismo lip dicoImagen SRS hiperespectral

Artículos relacionados