Artículo de método

Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana

DOI:

10.3791/61871

⸱

22 de septiembre de 2020

 , 
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método eficiente libre de células para la producción de proteoliposoma de alta calidad por el método de diálisis bicapa utilizando un sistema libre de células de trigo y liposomas. Este método proporciona medios adecuados para el análisis funcional de proteínas de membrana, detección de objetivos farmacológicos y desarrollo de anticuerpos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las proteínas de membrana desempeñan funciones esenciales en una variedad de procesos celulares y realizan funciones vitales. Las proteínas de membrana son médicamente importantes en el descubrimiento de fármacos porque son los objetivos de más de la mitad de todos los fármacos. Un obstáculo para la realización de estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales de las proteínas de membrana, así como el desarrollo de anticuerpos, ha sido la dificultad para producir grandes cantidades de proteína de membrana de alta calidad con conformación y actividad correctas. Aquí describimos un "método de diálisis bicapa" utilizando un sistema libre de células germinales de trigo, liposomas y copas de diálisis para sintetizar eficientemente proteínas de membrana y preparar proteoliposomas purificados en poco tiempo con una alta tasa de éxito. Las proteínas de membrana se pueden producir tanto como en varios miligramos, como GPCR, canales iónicos, transportadores y tetraspaninas. Este método libre de células contribuye a reducir el tiempo, el costo y el esfuerzo para preparar proteoliposas de alta calidad, y proporciona medios adecuados para el análisis funcional de proteínas de membrana, detección de objetivos farmacológicos y desarrollo de anticuerpos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las proteínas de membrana son uno de los objetivos farmacológicos más importantes en el diagnóstico y la terapéutica. De hecho, la mitad de los pequeños fármacos compuestos diana son proteínas de membrana, como los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) y los canales iónicos1. A lo largo de los años, los investigadores han estado trabajando en estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales de proteínas de membrana para dilucidar su estructura y función 2,3. El desarrollo de anticuerpos monoclonales contra proteínas de membrana también se realiza activamente con el fin de acelerar los estudios funcionales y estructurales y desarrollar aplicaciones terapéuticas y diagnósticas 4,5,6,7,8,9. Todos estos estudios requieren una gran cantidad de proteínas de membrana de alta calidad10. Por ejemplo, se necesitan varios miligramos de proteínas de membrana purificadas con conformación natural para el desarrollo de anticuerpos. Se requiere una cantidad mucho mayor de proteínas de membrana altamente purificadas para la cristalografía de rayos X. Sin embargo, la producción masiva de proteínas de membrana sigue siendo un cuello de botella en la investigación de proteínas de membrana11. Las proteínas de membrana tienen estructuras complicadas con una o más hélices transmembrana y juegan un papel importante en la homeostasis celular. La sobreexpresión heteróloga de proteínas de membrana conduce a múltiples obstáculos, como la agregación de proteínas de membrana que se acumulan a altas concentraciones locales o la alteración de las vías de señal celular. Incluso si la expresión es exitosa, los pasos posteriores de preparación de la muestra también enfrentan dificultades. Por ejemplo, la preparación del proteoliposoma requiere habilidades de alto nivel y experiencia profesional en solubilización, purificación y estabilización de proteínas de membrana, y también cuesta mucho esfuerzo y tiempo12,13.

Por otro lado, algunas tecnologías avanzadas han surgido en las últimas décadas para producir proteínas sin el uso de células vivas 14,15,16,17,18. La tecnología de síntesis de proteínas libres de células reconstituye la reacción de traducción en un tubo de ensayo. Dado que no hay limitaciones que tiene el sistema de expresión celular, los sistemas libres de células tienen potencial para sintetizar una variedad de proteínas que son difíciles de expresar o muestran toxicidad en las células. El extracto celular purificado o la maquinaria traslacional reconstituida se mezcla con ARNm plantilla, aminoácidos y fuentes de energía, y las proteínas recombinantes se sintetizan en poco tiempo. En cuanto a la síntesis de proteínas de membrana, a la reacción libre de células se añaden algunos tipos de andamios compuestos de lípidos o anfifilios, como liposomas, biceles, nanodiscos o copolímeros 19,20,21,22,23,24. Las proteínas de membrana sintetizadas interactúan con los andamios y pueden estabilizarse en agua. Las proteínas de membrana sintetizadas libres de células se utilizan ampliamente en estudios funcionales y producción de anticuerpos 25,26,27,28,29,30,31.

En este protocolo, describimos un método eficiente libre de células de producción de proteoliposomas utilizando un sistema libre de células de trigo y liposomas. El sistema de síntesis de proteínas libres de células de trigo es un potente sistema de traducción in vitro que utiliza extracto de germen de trigo 15,32,33. El germen de trigo contiene una gran cantidad de maquinaria de traducción y pocos inhibidores de traducción. La maquinaria de traslación en el trigo, un miembro de los eucariotas, es adecuada para traducir proteínas eucariotas, y su eficiencia de traducción apenas se ve afectada por el uso del codón del ARNm plantilla. Utilizando el sistema libre de células de trigo, hemos sintetizado una variedad de proteínas que incluyen proteínas quinasas 34,35, ligasas de ubiquitina36, factores de transcripción37 y proteínas de membrana con altas tasas de éxito. Para la producción de proteínas de membrana, agregamos liposoma de vesícula lipídica a la mezcla de traducción como andamio19,38. Los dominios hidrofóbicos de la proteína de membrana interactúan con la bicapa lipídica y se integran espontáneamente con el liposoma. La centrifugación por gradiente de densidad se utiliza para separar estrictamente el proteoliposoma de las proteínas endógenas del trigo, aunque una centrifugación común de la mezcla de reacción de traslación es suficiente para una purificación simple del proteoliposoma20. Muchos tipos de proteínas integrales de membrana han sido sintetizadas utilizando el sistema libre de células de trigo y aplicadas para diversas investigaciones y desarrollos 25,38,39,40,41,42,43,44. Además, desarrollamos el "método de diálisis bicapa" para la producción a gran escala45,46. En este método, el dispositivo de diálisis tipo copa se sumerge en el tampón de alimentación del sustrato, y se forman dos capas de mezcla de reacción de traducción y tampón de alimentación de sustrato en la copa, como se muestra en la Figura 1. El suministro continuo de sustratos y la eliminación del subproducto pueden llevarse a cabo de manera eficiente tanto en la parte superior como en la inferior de la mezcla de reacción durante mucho tiempo, lo que conduce a una excelente eficacia de traducción (Figura 2A y Figura 2B)45.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación del plásmido de expresión de pEU

NOTA: El plásmido de expresión de pEU debe incluir el codón de inicio, el marco de lectura abierto de la proteína de la membrana diana y el codón de parada en el fragmento (ver Figura 1). Agregue secuencias de etiquetas de detección/purificación en la posición adecuada cuando sea necesario. La digestión enzimática de restricción o la clonación sin fisuras son aplicables para la subclonación. Aquí describimos un protocolo utilizando un método de clonación sin fisuras.

  1. Preparar insertar fragmento de ADN.
    1. Amplificar el gen de interés mediante PCR utilizando la plantilla de ADNc, cebador 1 y cebador 2. El cebador 1 y el cebador 2 contienen superposiciones de 15 pb para una clonación perfecta, respectivamente (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: No incluya secuencias para ser procesadas y eliminadas de la proteína madura en las células (por ejemplo, secuencia de señal). El procesamiento de la proteína sintetizada no se realiza en el sistema libre de células de trigo. No agregue la secuencia de Kozak. El vector pEU-E01-MCS tiene potenciador de traslación E01.
    2. Agregue 1/25 de volumen de enzima de restricción DpnI al producto de PCR para eliminar el ADN plásmido plantilla. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Utilice un kit de purificación por PCR para purificar el producto de PCR y ajustar la concentración a 20-50 ng/μL.
  2. Linealizar el vector pEU-E01-MCS.
    1. Realizar PCR inversa utilizando pEU-E01-MCS, cebador 3 y cebador 4.
    2. Agregue 1/25 volumen de enzima de restricción DpnI al producto de PCR inversa. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Utilice un kit de purificación de PCR para purificar el producto de PCR según la recomendación del fabricante. Ajustar la concentración a 20-50 ng/μL.
  3. Mezcle 2 μL de fragmento de ADN de inserto, 2 μL de vector linealizado y 4 μL de 2x mezcla de enzimas de clonación sin costuras.
  4. Transforme la cepa JM109 de Escherichia coli con el producto de clonación sin costuras. Usando un esparcidor, extienda la suspensión bacteriana en una placa de agar LB-ampicilina.
    NOTA: El vector pEU tiene un marcador de resistencia a la ampicilina.
  5. Confirmar la secuencia del plásmido de expresión construido utilizando el cebador 5 y el cebador 6 del lado 5' y 3' de la SQM en plásmido pEU, respectivamente.
  6. Amplificar y purificar los plásmidos de expresión.
    1. Cultivar la cepa JM109 de E. coli transformada por plásmido en 150 ml de medio LB-ampicilina a 37 °C y 125 golpes por minuto agitando durante la noche.
    2. Extraiga y purifique los plásmidos utilizando el kit midi de preparación de plásmidos disponible comercialmente. Disolver plásmidos en 500 μL de tampón TE.
      PRECAUCIÓN: No utilice un mini kit de preparación para la extracción de plásmidos. No proporciona suficiente calidad y cantidad de plásmido.
    3. Añadir 500 μL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Mezclar vigorosamente durante 5 min, y centrifugar durante 5 min a 17.800 x g y temperatura ambiente. Transfiera la solución plásmida superior a un nuevo tubo.
      PRECAUCIÓN: Use guantes desechables para proteger la piel del fenol y el cloroformo.
      NOTA: Para eliminar la contaminación de la RNasa del kit de extracción de plásmidos, purifique los plásmidos utilizando la purificación de fenol-cloroformo.
    4. Agregue 500 μL de cloroformo para eliminar el fenol por completo. Mezclar vigorosamente durante 5 min, y centrifugar durante 5 min a 17.800 x g y temperatura ambiente. Transfiera la solución plásmida superior a un nuevo tubo.
    5. Añadir 2,5 volúmenes de etanol y 1/8 de volumen de acetato de amonio 7,5 M, y conservar a -30 °C durante 1 h.
    6. Centrifugadora a 17.800 x g a 4 °C durante 10 min. Lave el pellet con 500 μL de etanol al 70%. Retire el sobrenadante con cuidado y deje que el pellet se seque durante 5 minutos.
    7. Disolver completamente los plásmidos de expresión en 100 μL de agua ultrapura. Medir la concentración de plásmidos con absorbancia a 260 nm. Ajuste la concentración a 1 mg/ml.

2. Transcripción in vitro

PRECAUCIÓN: Use tubos y puntas de plástico sin DNasa y sin nucleasa en los pasos de transcripción y traducción. Evite esterilizar en autoclave los productos de plástico para evitar la contaminación.

  1. Cosecha agua ultrapura en un nuevo tubo de plástico.
    PRECAUCIÓN: No utilice agua tratada con DEPC porque el DEPC residual inhibe fuertemente la reacción. Use agua ultrapura recién purificada para la transcripción y traducción.
  2. Preparar la mezcla de reacción de transcripción mezclando 115,2 μL de agua ultrapura, 40 μL de tampón de transcripción LM, 20 μL de mezcla NTP, 2,4 μL de 80 U/μL de inhibidor de la RNasa, 2,4 μL de 80 U/μL SP6 polimerasa y 20 μL de plásmidos de expresión de pEU de 1 mg/ml. Mezclar los reactivos suavemente invirtiendo. Realiza un giro rápido.
  3. Incubar la reacción de transcripción a 37 °C durante 6 h.
  4. Mezclar la reacción suavemente invirtiendo y girar rápidamente hacia abajo. Úselo inmediatamente para la traducción, de lo contrario congele y guárdelo a -80 ° C.
  5. Confirmar el producto de transcripción mediante electroforesis.
    1. Mezclar 100 mL de 1x tampón TAE y 1 g de agarosa. Calentar la suspensión en un horno de microondas para preparar gel TAE de agarosa al 1%.
    2. Tomar 1 μL de reacción de transcripción y mezclar con 3 μL de agua y 4 μL de 2x colorante de carga.
      NOTA: No se requiere la desnaturalización del ARN.
    3. Cargue 4 μL de la mezcla y 2 μL de marcador de escalera de ADN al gel TAE de agarosa.
    4. Electroforeso a 100 V durante 20 min.
    5. Manchar el gel en bromuro de etidio durante 30 min. Verifique el patrón de banda de escalera del ARNm usando un transiluminador UV y un generador de imágenes de gel.
      NOTA: Cuando se observa una banda manchada de menos de 500 pb, se sospecha degradación del ARNm.

3. Preparación de materiales para traducción

  1. Prepare el búfer de traducción.
    1. Mezcle 27 ml de agua ultrapura recién preparada y 0,75 ml de cada solución madre 40x para S1, S2, S3 y S4, respectivamente, en un tubo de 50 ml.
      NOTA: Module las cantidades de materiales de acuerdo con la cantidad final requerida de 1x búfer de traducción.
      PRECAUCIÓN: No almacene ni vuelva a congelar el exceso de búfer de traducción 1x después de su uso.
  2. Prepare una solución madre de creatina quinasa. Disuelva la creatina quinasa liofilizada en agua ultrapura hasta una concentración final de 20 mg / ml. Dispensar la solución en pequeñas cantidades (10 a 50 μL cada una) en tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 ml. Congelar los tubos en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
    PRECAUCIÓN: No vuelva a congelar la solución de creatina quinasa después de la descongelación.
  3. Lave las tazas de diálisis (tamaño 0.1 ml) para eliminar el glicerol de la membrana de diálisis.
    NOTA: Hay varias tazas de diálisis de diferentes tamaños. Las tazas pequeñas (0,1 ml) se utilizan para la prueba a pequeña escala (sección 5.4) y las tazas grandes (2 ml) para la producción a gran escala (sección 5.5), respectivamente. El paso de lavado de la membrana de diálisis de tazas de gran tamaño es evitable.
    1. Ponga 1 ml de agua ultrapura en un nuevo tubo de 1,5 ml. Inserte una taza de diálisis de tamaño pequeño (0.1 ml) en el tubo. Agregue 0.5 ml de agua ultrapura en la taza.
    2. Incubar durante más de 30 min a temperatura ambiente.

4. Preparación de liposomas

NOTA: Aquí describimos dos protocolos para la preparación de liposomas. Uno utiliza liposomas liofilizados listos para usar (sección 4.1), mientras que el otro produce liposomas hidratando una película lipídica delgada (sección 4.2).

  1. Preparar liposomas usando liposomas liofilizados.
    NOTA: Una forma más fácil de producir proteoliposoma es usar liposoma de asolectina disponible comercialmente. La asolectina es un tipo de lípido natural extraído de la soja.
    1. Abra el vial que contiene 10 mg de liposomas de asolectina liofilizados (ver la tabla de materiales) y añada 200 μL de tampón de traducción (sección 3.1) al fondo del vial. Sellar el vial e incubar durante 10 min.
    2. Mezclar vigorosamente poniendo el vial en el mezclador de vórtices durante 1 min.
    3. Inserte el vial en un tubo de 50 ml. Girar el tubo centrifugando a 500 x g durante 1 min.
    4. Con una pipeta, transfiera la suspensión liposomal de asolectina (50 mg de lípidos/ml) a un nuevo tubo de 1,5 ml. Use el liposoma inmediatamente para la traducción, de lo contrario congele en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 ° C.
  2. Preparar los liposomas hidratando una película lipídica delgada.
    1. Si un lípido se vende en forma de polvo, disolver en cloroformo o disolvente orgánico apropiado a una concentración de 10-100 mg/ml.
      NOTA: Se puede preparar una película lipídica delgada utilizando lípidos anfifílicos purificados y/o sintetizados. El método de purificación de la asolectina se describe anteriormente38. Los lípidos modificados funcionalmente, como los lípidos biotinilados, los lípidos fluorescentes y los lípidos adyuvantes, se pueden agregar a los lípidos basales para producir liposomas funcionales.
    2. Transfiera la solución lipídica que contiene 50 mg de lípidos a un matraz de evaporación.
    3. Usando un evaporador rotativo, evapore el disolvente y extienda uniformemente el lípido en la pared del fondo del matraz para formar una película delgada de lípidos.
    4. Poner el matraz en un desecador al vacío y dejar bajo presión negativa durante la noche para eliminar el disolvente por completo.
    5. Añadir 1 ml de tampón de traslación al matraz de evaporación. Gire el matraz para extender el tampón sobre la película lipídica delgada. Incubar durante 5 min para hidratar la película.
    6. Sonicar el matraz con un homogeneizador ultrasónico o limpiador ultrasónico. Cambie el ángulo del matraz de vez en cuando para permitir que la solución toque bien la película. Asegúrese de que la película lipídica delgada se pela de la parte inferior y se emulsiona completa y homogéneamente.
      NOTA: La micrografía electrónica de lípidos biotinilados que contienen liposomas se muestra en la Figura 1.
    7. Transfiera la suspensión del liposoma (50 mg de lípidos/ml) a un nuevo tubo de 1,5 ml. Si no se va a utilizar inmediatamente, congelar los liposomas en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.

5. Traducción in vitro

  1. Descongele el extracto de germen de trigo rápidamente flotando los tubos en agua a temperatura ambiente durante unos minutos. Después de descongelar, mezcle inmediatamente suavemente invirtiendo los tubos, gire hacia abajo y enfríe en hielo hasta que lo use.
    NOTA: Congelar el extracto de germen de trigo en nitrógeno líquido después de su uso y almacenar a -80 °C. Soporta varios ciclos de congelación/descongelación.
  2. Descongele 20 mg/ml de solución madre de creatina quinasa. Mezclar 5 μL de solución madre y 45 μL de tampón de traducción para preparar 2 mg/ml de solución de trabajo de creatina quinasa.
    PRECAUCIÓN: No se recomienda volver a congelar la creatina quinasa.
  3. Descongele los liposomas o ARNm cuando sea necesario.
  4. Realizar una traducción de proteínas a pequeña escala.
    1. Retire el agua tanto de la sonda como de la taza de diálisis (0,1 ml), tal como se preparó en el paso 3.3.2.
    2. Inyecte 1 ml y 300 μL de tampón de traducción en el tubo y la copa de diálisis, respectivamente.
      PRECAUCIÓN: En caso de que la parte inferior de la copa de diálisis no alcance la superficie del tampón de traducción en el tubo de 1,5 ml, inyecte 50-100 μL adicionales de tampón en el tubo.
    3. Preparar la mezcla de reacción de traducción mezclando 15,6 μL de tampón de traducción, 2,4 μL de 2 mg/ml de creatina quinasa, 12 μL de liposomas de 50 mg/ml, 15 μL de extracto de germen de trigo y 15 μL de ARNm. Mezclar suavemente invirtiendo los tubos, y girar hacia abajo.
    4. Aspirar 60 μL de la mezcla de reacción de traslación utilizando una pipeta de 200 μL.
    5. Inserte la punta de la pipeta en la superficie inferior del tampón de traducción en la copa de diálisis. Pipetea la mezcla de reacción lenta y suavemente. Cubra la taza de diálisis con una tapa para evitar la evaporación.
      NOTA: La mezcla de reacción se hunde naturalmente hasta el fondo de la taza y forma una bicapa. No perturbe la bicapa mezclando o agitando la taza.
  5. Realizar una traducción a gran escala (Figura 1).
    1. Vierta 22 ml de tampón de traducción en un tubo de 25 ml. Inserte una taza de diálisis de tamaño grande (2 ml) en el tubo y agregue 2 ml de tampón de traducción en el vaso.
    2. Preparar una mezcla de reacción de traducción mezclando 130 μL de tampón de traducción, 20 μL de 2 mg/ml de creatina quinasa, 100 μL de 50 mg/ml de liposoma, 125 μL de extracto de germen de trigo y 125 μL de ARNm. Mezclar suavemente por pipeteo.
    3. Aspirar toda la mezcla de reacción de traslación (500 μL) utilizando una pipeta de 1.000 μL. Inyecte la mezcla de reacción de traducción en la copa de diálisis de la misma manera que se describe en el paso 5.4.5. Cubra la taza de diálisis con una tapa para evitar la evaporación.
  6. Incubar las reacciones a 15 °C durante 24 h.
  7. Mezclar bien la reacción en la taza de diálisis por pipeteo. Transfiera la suspensión de proteoliposoma crudo a un tubo nuevo.
    NOTA: Se recomienda un tubo de fondo plano de 1,5 ml para recoger el proteoliposoma de la traducción a pequeña escala. Después de la centrifugación, los liposomas forman gránulos compactos y fácilmente visibles en la esquina inferior del tubo.

6. Purificación de proteoliposomas

  1. Centrifugar el tubo que contiene la suspensión de proteoliposoma crudo a 17.800 x g a 4 °C durante 10 min.
  2. Retire el sobrenadante. Suspender el pellet de proteoliposoma en PBS (pequeña escala: 1 mL, gran escala: 10 mL) por pipeteo.
  3. Repita la centrifugación y el lavado de los proteoliposomas para otros dos círculos.
  4. Después del lavado, agregue una pequeña cantidad de PBS y vuelva a suspender bien el pellet de proteoliposoma mediante pipeteo. Mida el volumen de la suspensión con una micropipeta. Agregue PBS para ajustar el volumen a 60 μL (escala pequeña) o 500 μL (escala grande). Transfiera la suspensión a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  5. Transfiera 10 μL de suspensión proteoliposoma a un nuevo tubo de PCR para SDS-PAGE. Divida el resto de las muestras en porciones más pequeñas para usarlas cuando sea necesario. Congelar en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.

7. Tinción SDS-PAGE y CBB

  1. Añadir 70 μL de agua y 40 μL de tampón de muestra 3x SDS-PAGE a 10 μL de suspensión proteoliposómica.
    PRECAUCIÓN: No hierva la muestra SDS-PAGE, ya que las proteínas de membrana se agregan, y apenas penetran en el gel de acrilamida en la electroforesis. Además, agregue suficiente agente reductor al tampón de muestra SDS-PAGE (por ejemplo, 2-mercaptoetanol al 3% de concentración final) para evitar la oxidación.
  2. Coloque un gel SDS-PAGE de gradiente del 5% al 20% en una cámara de electroforesis. Carga 3 μL, 6 μL, 12 μL de muestras de proteoliposomas, 2 μL de marcador de tamaño de proteína y series estándar BSA también.
  3. Electroforeso a 52 mA, 400 V durante 30 min.
  4. Mancha el gel con tinte CBB durante 1 h. Decolorar en agua caliente y escanear la imagen de gel.
  5. Usando el software NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), cuantifique la intensidad de la banda de la proteína de membrana en cada carril. Estimar la cantidad de proteínas de membrana sintetizadas con series estándar BSA.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando este protocolo, se pueden obtener proteoliposomas parcialmente purificados en poco tiempo. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2A. Veinticinco GPCR de Clase A, B y C se sintetizaron con éxito utilizando el método de diálisis bicapa (pequeña escala) y se purificaron parcialmente por centrifugación y lavado tampón. Aunque la cantidad de proteínas sintetizadas varía según el tipo de proteína, generalmente se pueden sintetizar de 50 a 400 μg de proteínas de membrana po...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo presentado proporciona un método para producir proteínas de membrana con una alta tasa de éxito. Este protocolo es simple, altamente reproducible y fácil de escalar. También tiene el potencial de reducir el tiempo y el costo de los experimentos que consumen una gran cantidad de proteínas de membrana. El método de diálisis bicapa mejora la productividad de 4 a 10 veces en comparación con el método bicapa o el método de diálisis (Figura 2B)45. En un caso ex...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue apoyada por Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) de AMED bajo el número de subvención JP20am0101077. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por JSPS KAKENHI Número de subvención 20K05709.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
y tiempos; 3 tampón de muestra SDS-PAGEContiene 10% 2-mercaptoetanol
AgarosaTakara Bio
Acetato de amonioNakalai tesque02406-95Como este reactivo es delicuescente, disolverlo todo en agua una vez abierto y almacenarlo a -30ºC.
Ampicilina SódicaNakalai tesque02739-74
Asolectin Liposome, liofilizadoCellFree SciencesCFS-PLE-ASLUn vial contiene 10 mg de liposomas liofilizados.
Estándar1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 y micro; L y veces; 1 SDS-PAGE tampón de muestra
gel CBB
Clon de ADNc de interésPlásmido que alberga un clon de ADNc o un fragmento de ADN sintético
CloroformoNakalai tesque08402-84
IncubadoraTemperatura que oscila entre 0 y 40 °C C o más ancho.
Creatina quinasaRoche Diagnostics04524977190
Copa de diálisis (0,1 ml)Thermo Fisher Scientific69570Dispositivo de diálisis Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 mL
Copa de diálisis (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo de diálisis, 10K MWCO, 2 mL
escalera de ADNThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb ADN Escalera
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
Cepa de E. coli JM109
Cámara de electroforesisATTO
Etanol (99,5%)Nakalai tesque14713-95
Bromuro de etidio
evaporación, 100 mL
Escáner de gel
Utilizamosun escáner de documentos y un inmunizador LED como sustituto.
Caldo
Lípidos de interésAvanti Polar Lipids
Micro centrífugaTOMYMX-307
NTPmix CellFree SciencesCFS-TSC-NTPMezcla de ATP, GTP, CTP, UTP, a 25 mM cada uno
Tubo de 25 mL sin nucleasasIWAKI362-025-MYP
Tubos de plástico sin arrugasWatson bio labsNo lo haga en autoclave. Úselos por separado de otros experimentos.
Puntas sin arrugasWatson bio labsNo lo haga en autoclave. Úselos por separado de otros experimentos.
Kit de purificación de PCRTAMPÓN
PBS
pEU-E01-MCSCellFree SciencesCFS-11
Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Preparación de plásmidos Kit MidiMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Primer 1Thermo Fisher ScientificCustom oligo síntesis5'-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnn-3'
Imprimación específica del gen, adelante. Las mayúsculas muestran la secuencia de superposición que se agregará para una clonación sin problemas. Minúsculas nnnn…. (20-30 pb) muestra la secuencia específica del gen.
Primer 2Thermo Fisher ScientificCustom oligo síntesis5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnn
Imprimación específica del gen, inversa. Las mayúsculas muestran la secuencia de superposición que se agregará para una clonación sin problemas. Minúsculas nnnn…. (20-30 pb) muestra la secuencia específica del gen.
Primer 3Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Imprimación directa para la linealización vectorial. El subrayado funciona como superposición en la clonación sin interrupciones.
Imprimación 4Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Imprimación inversa para la linealización vectorial. El subrayado funciona como superposición en la clonación sin interrupciones.
Primer 5Thermo Fisher ScientificCustom oligo síntesis5'-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3'
Imprimación secuencial, cebador delantero
6Thermo Fisher ScientificCustom oligosíntesis5'- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3'
Imprimación de secuenciación, inversa
Marcador de tamaño de proteínaBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Evaporador
mezcla de enzimas de clonación sin costurasNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
También están disponibles otros reactivos de clonación sin costura.
ARN polimerasa SP6 & Inhibidor de ARNasaCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
de electroforesis submarino
Tampón TAE Tampón
transcripción LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Tampón de traducciónCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (&veces; 40) solución madre (S1, S2, S3, S4).
Preparación y tiempos; 1 tampón de traslación antes de su uso mezclando culata S1, S2, S3, culata S4 y agua ultrapura.
Aguaultrapura Recomendamos preparar agua ultrapura mediante el uso de un sistema de producción de agua ultrapura cada vez que experimente. No lo haga en autoclave.
Preparamos agua ultrapura utilizando Milli-Q Reference y el sistema Elix10.
El agua libre de nucleasas disponible comercialmente (no agua tratada con DEPC) se puede usar como sustituto. Ocúpate de la contaminación después de abrir la botella.
Homogeneizador ultrasónicoBransonSONIFIER modelo 450D-AdvancedEl limpiador ultrasónico se puede utilizar como sustituto.
Transiluminador
Desecador
Extracto de germen de trigoCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240
5-20% gradiente GEL SDOS-PAGE ATTO E-D520L 70% etanol Etanol diluido por agua ultrapura. BSA Tinción de refrigerada marcador de Matraz de LB MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel y limpieza de PCR vector rotativoSistema de UVde vacío

Referencias

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