Artículo de método

Procedimientos de trasplante de médula ósea en ratones para estudiar la hematopoyesis clonal

DOI:

10.3791/61875

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26 de mayo de 2021

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1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Describimos tres métodos de trasplante de la médula (BMT): BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación blindada, y método de BMT sin el pre-condicionamiento (BMT adoptivo) para el estudio de la hematopoyesis clónica en modelos del ratón.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La hematopoyesis clónica es una condición edad-asociada frecuente que resulta de la acumulación de mutaciones somáticas en las células hematopoyéticas del vástago y del progenitor (HSPCs). Las mutaciones en los genes impulsores, que confieren aptitud celular, pueden conducir al desarrollo de clones de HSPC en expansión que cada vez más dan lugar a leucocitos de progenie que albergan la mutación somática. Porque la hematopoyesis clónica se ha asociado a enfermedad cardíaca, al movimiento, y a mortalidad, el desarrollo de los sistemas experimentales que modelan estos procesos es dominante a entender los mecanismos que subly este nuevo factor de riesgo. Los procedimientos del trasplante de la médula que implican el condicionamiento myeloablative en ratones, tales como irradiación de cuerpo entero (TBI), se emplean comúnmente para estudiar el papel de células inmunes en enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, el daño simultáneo al nicho de la médula ósea y otros sitios de interés, como el corazón y el cerebro, es inevitable con estos procedimientos. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha desarrollado dos métodos alternativos para minimizar o evitar los posibles efectos secundarios causados por la LCT: 1) trasplante de médula ósea con blindaje de irradiación y 2) BMT adoptivo a ratones no acondicionados. En órganos blindados, el ambiente local se preserva permitiendo el análisis de la hematopoyesis clónica mientras que la función de células inmunes residentes es imperturbable. Por el contrario, el BMT adoptivo a ratones no acondicionados tiene la ventaja adicional de que tanto los ambientes locales de los órganos como el nicho hematopoyético se conservan. Aquí, comparamos tres diversos acercamientos hematopoyéticos de la reconstitución de la célula y discutimos sus fuerzas y limitaciones para los estudios de la hematopoyesis clónica en enfermedad cardiovascular.

Introducción

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La hematopoyesis clonal (CH) es una condición que se observa con frecuencia en individuos mayores y ocurre como resultado de un clon expandido de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) portador de una mutación genética1. Se ha sugerido que a la edad de 50 años, la mayoría de los individuos habrán adquirido un promedio de cinco mutaciones exónicas en cada HSPC2,pero la mayoría de estas mutaciones resultarán en pocas o ninguna consecuencia fenotípica para el individuo. Sin embargo, si por casualidad una de estas mutaciones confiere una ventaja competitiva al HSPC, por ejemplo, promoviendo su proliferación, auto-renovación, supervivencia o alguna combinación de estos, esto puede conducir a la expansión preferencial del clon mutante en relación con los otros HSPCs. Como consecuencia, la mutación se extenderá cada vez más a través del sistema hematopoyético mientras que el HSPC transformado da lugar a las células de sangre maduras, llevando a una población distinta de células transformadas dentro de la sangre periférica. Mientras que las mutaciones en docenas de genes conductores candidatos diferentes se han asociado con eventos clonales dentro del sistema hematopoyético, entre estos, las mutaciones en el ADN metiltransferasa 3 alfa(DNMT3A)y diez once translocaciones 2(TET2)son las más prevalentes3. Varios estudios epidemiológicos han encontrado que los individuos que llevan estas mutaciones genéticas tienen un riesgo perceptiblemente más alto de la enfermedad cardiovascular (CVD), del movimiento, y de la mortalidad todo-causal3,4,5,6,7. Mientras que estos estudios han identificado que existe una asociación entre el CH y la incidencia creciente del CVD y del movimiento, no sabemos si esta relación es causal o un epiphenomenon compartido con el proceso del envejecimiento. Para obtener una mejor comprensión de esta asociación, se requieren modelos animales adecuados que recapitulan correctamente la condición humana del CH.

Varios modelos animales ch han sido establecidos por nuestro grupo y otros utilizando pez cebra, ratones y primates no humanos8,9,10,11,12,13,14. Estos modelos a menudo utilizan métodos de reconstitución hematopoyética mediante trasplante de células modificadas genéticamente, a veces utilizando la recombinación Cre-lox o el sistema CRISPR. Este enfoque permite el análisis de una mutación genética específica en células hematopoyéticas para evaluar cómo contribuye al desarrollo de la enfermedad. Además, estos modelos emplean a menudo las células congénicas o del reportero para distinguir los efectos de células del mutante de las células normales o del salvaje-tipo. En muchos casos, se requiere un régimen de precondicionamiento para injerir con éxito las células madre hematopoyéticas donantes.

Actualmente, el trasplante de médula ósea a ratones receptores se puede dividir en dos categorías principales: 1) condicionamiento mieloablativo y 2) trasplante no condicionado. El condicionamiento mieloablativo puede lograrse por uno de dos métodos, a saber, la irradiación corporal total (LCT) o la quimioterapia15. La LCT se lleva a cabo sometiendo al receptor a una dosis letal de irradiación gamma o de rayos X, generando roturas de ADN o enlaces cruzados dentro de células que se dividen rápidamente, haciéndolas irreparables16. Busulfán y ciclofosfamida son dos medicamentos de quimioterapia de uso común que interrumpen el nicho hematopoyético y causan de manera similar daño en el ADN a las células que se dividen rápidamente. El resultado neto del preacondicionamiento mieloablativo es la apoptosis de las células hematopoyéticas, que destruye el sistema hematopoyético del receptor. Esta estrategia no sólo permite el engraftment acertado del HSPCs dispensador de aceite, pero puede también prevenir el rechazo del injerto suprimiendo el sistema inmune del recipiente. Sin embargo, el preacondicionamiento mieloablativo tiene efectos secundarios graves, como daño a los tejidos y órganos y a sus células inmunitarias residentes, así como la destrucción del nicho de médula ósea nativa17. Por lo tanto, se han propuesto métodos alternativos para superar estos efectos secundarios indeseables, particularmente en lo que respecta al daño a los órganos de interés. Estos métodos incluyen la irradiación blindada de ratones receptores y el BMT adoptivo a ratones no acondicionados9,17. El blindaje del tórax, la cavidad abdominal, la cabeza u otras regiones de la irradiación mediante la colocación de barreras de plomo mantiene los tejidos de interés protegidos de los efectos perjudiciales de la irradiación y mantiene su población de células inmunes residentes. Por otro lado, el BMT adoptivo de HSPCs a ratones no acondicionados tiene una ventaja adicional porque preserva el nicho hematopoyético nativo. En este manuscrito, se describen los protocolos y resultados de la injerto de HSPC después de varios regímenes de trasplante en ratones, específicamente la entrega de HSPC a ratones TBI, a ratones parcialmente protegidos de la irradiación, y a ratones no acondicionados. El objetivo general es ayudar a los investigadores a comprender los diferentes efectos fisiológicos de cada método, así como cómo afectan los resultados experimentales en el contexto del CH y las enfermedades cardiovasculares.

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Protocolo

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Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia.

1. Antes del preacondicionamiento

  1. Coloque los ratones receptores en agua suplementada con antibióticos (5 mM de sulfametoxazol, 0,86 mM de trimetoprima) ~ 24 h antes de la irradiación. Esto es necesario para prevenir la infección, ya que el sistema inmunológico se suprimirá después de la irradiación y se mantendrá durante 2 semanas después de la irradiación. En este punto, complemente a los ratones con un gel nutricional / hidratante para fomentar la alimentación y prevenir la pérdida de peso y la deshidratación después de la irradiación.

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Figura 1: Imágenes que muestran varias configuraciones de preacondicionamiento. (A) Configuración de irradiación corporal total en jaula circular utilizando rayos gamma (Cesio-137): El haz de radiación proviene de la parte posterior del irradiador en la dirección del eje Y (radiación horizontal). (B)Configuración de irradiación corporal total de la jaula del ratón mediante rayos X: La jaula del ratón se coloca en la cámara reflectante. El haz de radiación proviene de la parte superior del irradiador en forma de cono (radiación vertical). La distancia desde la fuente de radiación hasta la jaula es de 530 mm. (C) Bandeja ajustable en irradiador de rayos X: Esta configuración se utiliza para la irradiación parcialmente blindada mediante rayos X. El haz de radiación proviene de la parte superior del irradiador en forma de cono (radiación vertical). La distancia desde la fuente de radiación hasta la bandeja es de 373 mm, y el radio es de 250 mm. (D) Blindaje de tórax: Los ratones anestesiados se colocan en una bandeja. Los ratones se colocan invertidos entre sí en posiciones supinas con los brazos y las piernas completamente extendidos. El extremo inferior del escudo de plomo está alineado con el hueso xiphisternum y el extremo superior con el timo. (E) Blindaje abdominal: Los ratones anestesiados se colocan como en la configuración de blindaje del tórax con el extremo inferior del escudo de plomo alineado con el ano y el extremo superior debajo del diafragma. (F) Configuración de irradiación de protección de la cabeza utilizando rayos gamma (Cesio-137): Las sierras de los antepesos del ratón anestesiado se graban hacia abajo y el ratón se coloca en un sujeción cónica. El escudo de plomo negro (marcado) cubre la cabeza y las orejas del ratón. El haz de radiación proviene de la parte posterior del irradiador en la dirección del eje Y (radiación horizontal). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

2. Preacondicionamiento de ratones receptores (opcional)

  1. Irradiación corporal total
    1. Coloque los ratones receptores en una jaula de pastel uniformemente cortada, o en una jaula de ratón en la cámara reflectante dentro del radio calculado para recibir la misma dosis de irradiación; sin embargo, se recomienda un máximo de 8 ratones por jaula de pastel y 5 ratones por jaula de ratón para garantizar una irradiación uniforme (Figura 1A,B).
    2. Para lograr la mieloablación completa, asegúrese de que los ratones receptores reciban una dosis total de radiación de 11 Gy en dos fracciones de 5,5 Gy separadas por un intervalo de 4-24 h.
      NOTA: Mientras que el engraftment óptimo se puede obtener implementando un intervalo de 4 h entre las fracciones, éste se puede extender a un intervalo de 24 h, que puede ser provechoso cuando el trabajo y/o el irradiador no están disponibles.
  2. Irradiación parcialmente blindada
    1. Anestesiar a los ratones receptores mediante inyección intraperitoneal de ketamina (80–100 mg/kg) y xilazina (5–10 mg/kg). La restricción del movimiento del ratón es fundamental para garantizar la irradiación uniforme y la protección eficaz de los órganos diana durante el proceso de blindaje.
    2. Para el blindaje de tórax y abdomen, oriente el haz de radiación del irradiador de rayos X verticalmente al ratón (Figura 1C).
      1. Coloque los ratones anestesiados en una placa plana, centrando la fuente de radiación desde arriba. Coloque los ratones invertidos entre sí en una posición supina con los brazos y las piernas completamente extendidos (Figura 1D,E).
        NOTA: La instalación de irradiador de rayos X, para este experimento, permite que dos ratones a la vez se puedan colocar dentro del radio efectivo que permite una irradiación uniforme. Mientras que el radio efectivo se calcula sobre la base de la distancia entre la fuente de radiación y la bandeja, el número de animales que pueden ser irradiados simultáneamente dependerá del irradiador específico.
      2. Suba las patas de los ratones a la placa usando cinta adhesiva para asegurarse de que los ratones estén inmovilizados durante el procedimiento de irradiación. Coloque el blindaje de plomo para que cubra las regiones que requieren protección.
      3. Para el blindaje del tórax, prepare el escudo de plomo midiendo la longitud desde el hueso xiphisternum del ratón hasta el timo y calculando el grosor que proporcionará suficiente protección contra la fuente de irradiación. Coloque el blindaje de plomo para que el extremo inferior se alinee con el hueso xiphisternum. El extremo superior de la barrera de plomo se ajustará cerca del timo (Figura 1D).
      4. Para el blindaje del abdomen, prepare el escudo de plomo midiendo la longitud desde el ano del ratón hasta el diafragma y calculando el grosor que proporcionará suficiente protección contra la fuente de irradiación. Coloque el blindaje de plomo para que el extremo inferior se alinee con el ano. El extremo superior del escudo de plomo se ajustará debajo del diafragma (Figura 1E).
        NOTA: Localizar el escudo de plomo para que sea consistente entre las cohortes puede reducir alguna variación con respecto al tamaño de los ratones.
    3. Para el blindaje de la cabeza, oriente el haz de radiación del irradiador de cesio horizontalmente al ratón.
      1. Pegue cuidadosamente las sierras de anteoje de un ratón anestesiado al abdomen. Esto asegura que los brazos reciban una dosis completa de irradiación y no estén cubiertos por el escudo.
      2. Para el blindaje de la cabeza, coloque el ratón en un sujeción cónica, que cabe dentro de un escudo de plomo. Una vez que el ratón está dentro del sujeción cónica, deslice el sujeción en la ranura dentro del escudo de plomo (Figura 1F). El escudo de plomo debe cubrir completamente la cabeza y las orejas del ratón (~ 3,2 cm), dejando el resto del cuerpo del ratón expuesto para la irradiación. La posición del sujetador dentro del escudo se puede ajustar para adaptarse a los animales de diferentes tamaños deslizándolo más dentro o fuera del escudo.
      3. Coloque ratones dentro del irradiador, perpendicularmente a la fuente para la irradiación.
    4. Exponga a los ratones a dos fracciones de irradiación de 5,5 Gy (dosis total de 11 Gy) separadas por un intervalo de 4-24 h.
    5. Después de cada fracción de irradiación, coloque las jaulas con ratones anestesiados en esteras calentadas o debajo de lámparas de calor rojas para prevenir la hipotermia y ayudar en la recuperación de la anestesia.
      NOTA: Se debe tener precaución para no sobrecalentar el ratón anestesiado cuando se utiliza una lámpara, ya que no pueden escapar del calor. Como se ha descrito anteriormente, la posición de los animales y el espesor del escudo de plomo pueden diferir entre los estudios basados en las características específicas del irradiador (tipo de radiación/dirección del haz, etc.). Los investigadores tendrán que ajustar sus experimentos en consecuencia.

3. Aislamiento óseo

NOTA: Idealmente, los ratones donantes y los ratones receptores deben ser similares en edad, y dentro de las 8-12 semanas de edad. Se prefiere usar al menos 3 ratones como donantes (en lugar de un solo donante) para minimizar la heterogeneidad (incluso cuando se usan ratones con el mismo genotipo). Aproximadamente, se pueden obtener 40 millones de células de médula ósea no fraccionadas de seis huesos (dos fémures, dos tibias y dos hómemos) de un solo ratón. El trasplante de 5 millones de células de médula ósea a cada ratón receptor normalmente asegurará el injerto.

  1. Eutanasiar ratones donantes por dislocación cervical sin anestesia (método preferido para evitar la contaminación química de las células) y colocar cada ratón en una almohadilla absorbente.
  2. Desinfecte la piel con un spray de etanol al 70%.
  3. Haga un pequeño corte transversal en la piel debajo de la caja torácica y sostenga la piel firmemente a cada lado de la incisión, desgarre en direcciones opuestas hacia la cabeza y los pies. Desprenda la piel de todas las extremidades.
  4. Corte sobre los hombros y las articulaciones del codo, y retire los músculos unidos y los tejidos conectivos con la ayuda de un Kimwipe para obtener los húmedos.
  5. Dislote cuidadosamente las articulaciones de la cadera entre el fémur y los huesos de la cadera. Use tijeras romas para cortar a lo largo de la cabeza del fémur y despegar las piernas. Corte sobre la articulación de la rodilla para separar el fémur y la tibia, y retire cuidadosamente los músculos unidos y los tejidos conectivos con la ayuda de un Kimwipe para cosechar el fémur y la tibia.
    NOTA: Preste especial atención para mantener la epífisis ósea intacta durante este paso. Deseche cualquier hueso roto debido a la pérdida de esterilidad. Los huesos de la cadera y los huesos de la columna vertebral se pueden recolectar además del fémur, la tibia y el húmero. Para recoger los huesos de la columna vertebral, se puede utilizar un mortero y un pestle para aplastar los huesos en pedazos y cosechar las células de la médula ósea.
  6. Coloque los huesos aislados de ratones del mismo genotipo en un tubo cónico correspondientemente de 50 mL que contenga PBS estéril helado de 20 mL, y manténgalo en hielo hasta su posterior uso. Preste especial atención a colocar correctamente los huesos en tubos con genotipos emparejados.
  7. Repita los pasos anteriores para cada animal donante cambiando los guantes entre cada ratón. Además, limpie las tijeras y otros instrumentos con etanol al 70% entre cada ratón.

4. Aislamiento de células de la médula ósea

NOTA: Realice los siguientes pasos en un gabinete de clase II de bioseguridad.

  1. Preparación de conjuntos de tubos: Haga un pequeño agujero en la parte inferior de un tubo estéril de microcentrífuga de 0,5 mL usando una aguja de 18 G y colóquelo en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL, que contiene 100 μL de PBS estéril helado en la parte inferior.
    NOTA: Como solo seis huesos pueden caber en el tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, se recomienda preparar suficientes conjuntos de tubos para procesar todos los huesos al mismo tiempo.
  2. Aspirar el PBS y transferir los huesos aislados en un plato estéril de cultivo celular de 100 mm. Sosteniendo cada hueso usando fórceps finos, corte cuidadosamente las epífidas de cada extremo usando pequeñas tijeras que fueron esterilizadas en un autoclave. Coloque los huesos cortados en los juegos de tubos preparados.
  3. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 35 s a 4 °C.
  4. Después de la centrifugación, confirme que la médula ósea se ha eliminado con éxito de los huesos. Los huesos deben aparecer blancos y translúcidos con un pellet rojo relativamente grande en la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Deseche el tubo de microcentrífuga de 0,5 mL.
    NOTA: Si la inspección visual no detecta la médula ósea en la parte inferior del tubo de 1,5 mL, vuelva a cortar el hueso y repita el paso 4.3.
  5. Resuspend la médula ósea en 1 mL de PBS helado, luego transfiera la suspensión celular del mismo genotipo a un tubo cónico de 50 mL emparejado.
  6. Disociar las células pasándolas a través de una aguja de 18 G con una jeringa de 10 ml 10 veces.
  7. Filtre las suspensiones unicelulares a través de un colador de células de 70 μm. Agregue PBS helado adicional a un volumen final de 10 mL y vuelva apentir las células mediante el uso suave de pipeta-aid.
  8. Centrífuga a 310 x g durante 10 min a 4 °C.
  9. Aspirar el sobrenadante y resuspend el pellet celular con 10 mL de medios RPMI sin suero. Repuesto 30 μL de este material para el conteo celular.
  10. Determinar la concentración celular con un contador celular y calcular el volumen de suspensión celular necesario para el trasplante. Para el ejemplo de un 100% BMT, se requieren 5 x 106 células de médula ósea para cada ratón receptor.
    NOTA: Para un BMT competitivo, prepare un total de 5 x 106 células de la médula que comprenden una mezcla de células dispensadoras de aceite (e.g., CD45.2+)y de células de la competidor (e.g., CD45.1+). La preparación de células adicionales de la médula ósea es muy recomendable. Por ejemplo, si hay 10 ratones receptores por grupo experimental, normalmente preparamos suficientes células para 12 ratones receptores.
  11. Transfiera el volumen calculado de suspensión celular a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Centrífuga a 310 x g durante 10 min a 4 °C.
  12. Aspirar el sobrenadante y resuspend las células utilizando la cantidad calculada de medio RPMI sin suero para lograr la densidad y el volumen celulares apropiados. Típicamente, 200 μL es el volumen óptimo para una inyección retro-orbital.

5. Trasplante de células de médula ósea a ratones irradiados

  1. Anestesiar los ratones receptores con isoflurano al 5%.
  2. Mientras los ratones son anestesiados, inyecte lentamente 200 μL de células de médula ósea en la vena retro-orbital usando una aguja de 28-30 G con una jeringa de insulina.
    1. Alternativamente, realizar la entrega de las células donantes por inyección intravenosa de vena de cola e inyección intramedular femoral, con un volumen máximo de 0,2 mL y 25 μL, respectivamente.
  3. Una vez que se inyectan las células, coloque una gota de gotas para los ojos que contienen proparacaína en la superficie del ojo para aliviar el dolor. Entonces se puede permitir que el animal recupere la conciencia.

6. Trasplante de células de médula ósea a ratones no acondicionados

  1. Anestesiar los ratones receptores por inhalación de isoflurano al 5%.
  2. Inyecte 5 x 106 células de médula ósea no fraccionadas de cualquiera de los genotipos retro-orbitalmente en ratones receptores no irradiados con jeringa de insulina de 28-30 G.
  3. Repita los pasos 6.1 y 6.2 durante 3 días consecutivos, de modo que los ratones receptores serán trasplantados con un total de 1,5 x 107 células de médula ósea.
    NOTA: Debido a que el BMT adoptivo sin procedimiento de precondicionamiento requiere el trasplante de médula ósea durante 3 días consecutivos, uno debe intentar alternar los ojos para cada inyección.
  4. Después de la inyección, administrar una gota de gotas para los ojos que contienen proparacaína al ojo afectado.

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Resultados

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Para comparar el efecto de tres métodos de BMT/pre-conditioning sobre el engraftment dispensador de aceite de la célula, las fracciones de células dispensadoras de aceite en sangre periférica y tejido del corazón eran analizadas por cytometry de flujo en el poste-BMT de 1 mes. Las células aisladas fueron manchadas para que los marcadores específicos del leucocito identifiquen los diversos subconjuntos de leucocitos. En estos experimentos, el salvaje-tipo(PESO) C57BL/6 (CD45.2) las células dispensadoras de aceite...

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Discusión

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Para los estudios de la hematopoyesis clónica, describimos tres métodos de BMT: BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación con el blindaje parcial, y un método menos de uso general de BMT que no implique ningún pre-condicionamiento (BMT adoptivo). Estos métodos se han utilizado para evaluar el impacto de la hematopoyesis clónica en la enfermedad cardiovascular. Los investigadores pueden modificar estos métodos en consecuencia para adaptarse al propósito específico de su estudio.

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos a K. Walsh (HL131006, HL138014 y HL132564), a S. Sano (HL152174), la subvención de la Asociación Americana del Corazón a M. A. Evans (20POST35210098) y una subvención de la Japan Heart Foundation a H. Ogawa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microcentrífuga de 0,5 mlFisher Scientific05-408-121suministro general
Microcentrífuga de 1,5 mlFisher Scientific05-408-129suministro general
1/2 cc JERINGA DE INSULINA DE DOSIS BAJAEXELINT26028general
Etanol absoluto (200 prfof)Fisher suministro químico200559
general BD 1mL Tuberculina Jeringas 25G 5/8 pulgadas AgujaBecton Dickinson309626 suministro general
BD PrecisionGlide Aguja 18G (1,22 mm x 25 mm)Becton Dickinson395195suministro general
Cesio-137 IrradiadorJ. L. Shepherd EquipoMark IV
DietGel 76AClear H2O70-01-5022general
Falcon 100 mm Plato de cultivo celular tratado con TCde la Vida353003suministro general
Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos FisherScientific352098suministro general
Fisherbrand filtros de células estériles, 70 μ mFisher Scientific22363548suministro general
Pinzas GraefeFine Science Tools11051-10Suministro general
Tijeras finas endurecidasFine Science Tools14090-09general
Solución de isothesia (isoflurano)Henry Schein29404Solución
KetaminaZoetis043-304inyección
Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadasKimtech ScienceKCC34155suministro general
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
RadDisk – Disco de irradiador de roedoresBraintree ScientificIRD-P Msuministro general
RPMI Medio 1640 (1X)Gibco11875-093Medio
Sulfametoxazol y TrimetoprimaTEVA0703-9526-01inyección
XilacinaAkorn139-236inyección
Irradiador de rayos XFuente de radiación EquipoRS-2000
suministro suministro Ciencias suministro

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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