Describimos tres métodos de trasplante de la médula (BMT): BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación blindada, y método de BMT sin el pre-condicionamiento (BMT adoptivo) para el estudio de la hematopoyesis clónica en modelos del ratón.
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Artículo de método
Procedimientos de trasplante de médula ósea en ratones para estudiar la hematopoyesis clonal
En este artículo
Resumen
Resumen
La hematopoyesis clónica es una condición edad-asociada frecuente que resulta de la acumulación de mutaciones somáticas en las células hematopoyéticas del vástago y del progenitor (HSPCs). Las mutaciones en los genes impulsores, que confieren aptitud celular, pueden conducir al desarrollo de clones de HSPC en expansión que cada vez más dan lugar a leucocitos de progenie que albergan la mutación somática. Porque la hematopoyesis clónica se ha asociado a enfermedad cardíaca, al movimiento, y a mortalidad, el desarrollo de los sistemas experimentales que modelan estos procesos es dominante a entender los mecanismos que subly este nuevo factor de riesgo. Los procedimientos del trasplante de la médula que implican el condicionamiento myeloablative en ratones, tales como irradiación de cuerpo entero (TBI), se emplean comúnmente para estudiar el papel de células inmunes en enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, el daño simultáneo al nicho de la médula ósea y otros sitios de interés, como el corazón y el cerebro, es inevitable con estos procedimientos. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha desarrollado dos métodos alternativos para minimizar o evitar los posibles efectos secundarios causados por la LCT: 1) trasplante de médula ósea con blindaje de irradiación y 2) BMT adoptivo a ratones no acondicionados. En órganos blindados, el ambiente local se preserva permitiendo el análisis de la hematopoyesis clónica mientras que la función de células inmunes residentes es imperturbable. Por el contrario, el BMT adoptivo a ratones no acondicionados tiene la ventaja adicional de que tanto los ambientes locales de los órganos como el nicho hematopoyético se conservan. Aquí, comparamos tres diversos acercamientos hematopoyéticos de la reconstitución de la célula y discutimos sus fuerzas y limitaciones para los estudios de la hematopoyesis clónica en enfermedad cardiovascular.
Introducción
La hematopoyesis clonal (CH) es una condición que se observa con frecuencia en individuos mayores y ocurre como resultado de un clon expandido de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) portador de una mutación genética1. Se ha sugerido que a la edad de 50 años, la mayoría de los individuos habrán adquirido un promedio de cinco mutaciones exónicas en cada HSPC2,pero la mayoría de estas mutaciones resultarán en pocas o ninguna consecuencia fenotípica para el individuo. Sin embargo, si por casualidad una de estas mutaciones confiere una ventaja competitiva al HSPC, por ejemplo, promoviendo su proliferación, aut....
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia.
1. Antes del preacondicionamiento
- Coloque los ratones receptores en agua suplementada con antibióticos (5 mM de sulfametoxazol, 0,86 mM de trimetoprima) ~ 24 h antes de la irradiación. Esto es necesario para prevenir la infección, ya que el sistema inmunológico se suprimirá después de la irradiación y se mantendrá durante 2 semanas después de la irradiación. En este punto, complemente a los ratones con un gel nutricional / hidratante para fomentar la alimentació....
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Resultados
Para comparar el efecto de tres métodos de BMT/pre-conditioning sobre el engraftment dispensador de aceite de la célula, las fracciones de células dispensadoras de aceite en sangre periférica y tejido del corazón eran analizadas por cytometry de flujo en el poste-BMT de 1 mes. Las células aisladas fueron manchadas para que los marcadores específicos del leucocito identifiquen los diversos subconjuntos de leucocitos. En estos experimentos, el salvaje-tipo(PESO) C57BL/6 (CD45.2) las células dispensadoras de aceite.......
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Discusión
Para los estudios de la hematopoyesis clónica, describimos tres métodos de BMT: BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación con el blindaje parcial, y un método menos de uso general de BMT que no implique ningún pre-condicionamiento (BMT adoptivo). Estos métodos se han utilizado para evaluar el impacto de la hematopoyesis clónica en la enfermedad cardiovascular. Los investigadores pueden modificar estos métodos en consecuencia para adaptarse al propósito específico de su estudio.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos a K. Walsh (HL131006, HL138014 y HL132564), a S. Sano (HL152174), la subvención de la Asociación Americana del Corazón a M. A. Evans (20POST35210098) y una subvención de la Japan Heart Foundation a H. Ogawa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microcentrífuga de 0,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-121 | suministro general |
| Microcentrífuga de 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | suministro general |
| 1/2 cc JERINGA DE INSULINA DE DOSIS BAJA | EXELINT | 26028 | general |
| Etanol absoluto (200 prfof) | Fisher suministro químico | 200559 | |
| general BD 1mL Tuberculina Jeringas 25G 5/8 pulgadas Aguja | Becton Dickinson | 309626 suministro general | |
| BD PrecisionGlide Aguja 18G (1,22 mm x 25 mm) | Becton Dickinson | 395195 | suministro general |
| Cesio-137 Irradiador | J. L. Shepherd | Equipo | Mark IV |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general |
| Falcon 100 mm Plato de cultivo celular tratado con TC | de la Vida | 353003 | suministro general |
| Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos Fisher | Scientific | 352098 | suministro general |
| Fisherbrand filtros de células estériles, 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | suministro general |
| Pinzas Graefe | Fine Science Tools | 11051-10 | Suministro general |
| Tijeras finas endurecidas | Fine Science Tools | 14090-09 | general |
| Solución de isothesia (isoflurano) | Henry Schein | 29404 | Solución |
| Ketamina | Zoetis | 043-304 | inyección |
| Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas | Kimtech Science | KCC34155 | suministro general |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Disco de irradiador de roedores | Braintree Scientific | IRD-P M | suministro general |
| RPMI Medio 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medio |
| Sulfametoxazol y Trimetoprima | TEVA | 0703-9526-01 | inyección |
| Xilacina | Akorn | 139-236 | inyección |
| Irradiador de rayos X | Fuente de radiación Equipo | RS-2000 |
Referencias
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.....
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Reimpresiones y permisos
