Caracterización y predicción funcional de bacterias en tejidos ováricos

Resumen

Se realizó la tinción inmunohistoquímica y la secuenciación del gen arn ribosómico 16S (gen 16S rRNA) con el fin de descubrir y distinguir bacterias en tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos in situ. Las diferencias composicionales y funcionales de las bacterias se predijeron mediante el uso de BugBase y Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unbserved States (PICRUSt).

Resumen

La teoría de un tracto reproductivo superior femenino "estéril" ha estado encontrando una creciente oposición debido a los avances en la detección bacteriana. Sin embargo, aún no se ha confirmado si los ovarios contienen bacterias. Aquí, se introdujo un experimento para detectar bacterias en los tejidos ováricos. Elegimos pacientes con cáncer de ovario en el grupo de cáncer y pacientes no cancerosas en el grupo de control. La secuenciación del gen 16S rRNA se utilizó para diferenciar las bacterias en los tejidos ováricos de los grupos de cáncer y control. Además, predijimos la composición funcional de las bacterias identificadas mediante el uso de BugBase y PICRUSt. Este método también se puede utilizar en otras vísceras y tejidos, ya que se ha demostrado que muchos órganos albergan bacterias en los últimos años. La presencia de bacterias en las vísceras y los tejidos puede ayudar a los científicos a evaluar los tejidos cancerosos y normales y puede ser de ayuda en el tratamiento del cáncer.

Introducción

Recientemente, se ha publicado un número creciente de artículos que prueban la existencia de bacterias en las vísceras sólidas abdominales, como el riñón, el bazo, el hígado y el ovario^1,2. Geller et al. encontraron bacterias en tumores pancreáticos, y estas bacterias eran resistentes a la gemcitabina, un fármaco quimioterapéutico². S. Manfredo Vieira et al. concluyeron que Enterococcus gallinarum era portátil a los ganglios linfáticos, hígado y bazo, y podía conducir a la autoinmunidad³.

Dado que el cuello uterino desempeña un papel como defensor, las bacterias en el tracto reproductivo femenino superior, que contiene el útero, las trompas de Falopio y los ovarios, se han investigado mínimamente. Sin embargo, algunas nuevas teorías se han establecido en los últimos años. Las bacterias pueden tener acceso a la cavidad uterina durante el ciclo menstrual debido a cambios en las mucinas^4,5. Además, Zervomanolakis et al. confirmaron que el útero, junto con las trompas de Falopio, es una bomba peristáltica controlada por el sistema endocrino de los ovarios, y esta disposición permite que las bacterias ingresen al endometrio, las trompas de Falopio y los ovarios⁶.

El tracto reproductivo superior ya no es un misterio gracias al desarrollo de métodos de detección bacteriana. Verstraelen et al. utilizaron un método de secuenciación de extremo pareado con código de barras para descubrir bacterias uterinas dirigiéndose a la región hipervariable V1-2 del gen 16S^{RNA 7}. Fang et al. emplearon la secuenciación con código de barras en pacientes con pólipos endometriales y revelaron la presencia de diversas bacterias intrauterinas⁸. Además, mediante el uso del gen arn 16S, Miles et al. y Chen et al. encontraron bacterias en el sistema genital de mujeres que se habían sometido a salpingoooforectomía e histerectomía, respectivamente^5,9.

Las bacterias en los tejidos tumorales han ganado cada vez más atención en los últimos años. Banerjee et al. descubrieron que la firma del microbioma difería entre las pacientes con cáncer de ovario y los controles¹⁰. Unnoxynatronum sibiricum se asoció con el estadio tumoral, y Methanosarcina vacuolata podría usarse para diagnosticar el cáncer de ovario¹¹. Además del cáncer de ovario, se ha demostrado que otros cánceres, como el de estómago, pulmón, próstata, mama, cuello uterino y endometrio, están asociados con las bacterias^{12,13,14,15,16,17,18.} Poore et al. propusieron una nueva clase de diagnósticos oncológicos basados en microbios, previendo el cribado del cáncer en etapa temprana¹⁹. En este protocolo, investigamos las diferencias entre los tejidos ováricos cancerosos y normales comparando la composición y función de las bacterias en estos dos tejidos.

Se realizó tinción inmunohistoquímica y secuenciación del gen 16S rRNA para confirmar la presencia de bacterias en los ovarios. Se estudiaron las diferencias y las funciones predichas de las bacterias ováricas en los tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos. Los resultados mostraron la existencia de bacterias en los tejidos ováricos. Anoxynatronum sibiricum y Methanosarcina vacuolata se relacionaron con el estadio y el diagnóstico de cáncer de ovario, respectivamente. Se compararon cuarenta y seis vías kegg significativamente diferentes que estaban presentes en ambos grupos.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional Médica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Xi'an Jiaotong (No. XJTUIAF2018LSK-139). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes inscritos.

1. Criterios para ingresar al grupo de cáncer y al grupo de control

1. Para el grupo de cáncer, inscriba a pacientes que son diagnosticadas principalmente con cáncer de ovario, y después de la laparotomía, se demuestra que tienen cáncer de ovario seroso por hallazgos patológicos.
2. Para el grupo de control, inscriba a pacientes que son diagnosticadas principalmente con mioma uterino o adenomiosis uterina, sin presentar ninguna afección ovárica, y que se han sometido a histerectomía y salpingooforectomía.
   NOTA: Esta norma no es definitiva. Las pacientes con enfermedades que no afectan los ovarios que se someten a histerectomía y salpingooforectomía también pueden inscribirse.
3. Excluir a los pacientes con uno o más de los siguientes criterios:
   Mujeres embarazadas o en lactancia.
   Tomar antibióticos 2 meses antes de la cirugía.
   Tener fiebre o marcadores inflamatorios elevados.
   Tener inflamación de cualquier tipo.
   Haber sido sometido a quimioterapia neoadyuvante.

2. Recoger muestras

1. Durante la cirugía, coloque los ovarios resecados en un tubo estéril y coloque el tubo en nitrógeno líquido para su transporte. Evite tocar cualquier otra cosa durante todo el procedimiento.
2. Separe los ovarios en muestras de tejido de aproximadamente 1 cm de grosor con un par de nuevas pinzas estériles debajo de un gabinete de flujo laminar. Después de la separación, conservar las muestras a -80 °C.
   NOTA: Todos los procedimientos para la recolección de muestras son asépticos, incluida la separación de los ovarios.

3. Secuenciar el gen 16S rRNA

1. Extraer ADN.
   1. Agregue 1.2 ml de tampón ex inhibido en un tubo centrífugo de 2 ml. Luego, agregue 180-220 mg de muestras en el tubo. Deje que la muestra se mezcle completamente (baño de agua a 70 °C durante 5 min y luego vórtice durante 15 s).
   2. Centrifugar el tubo durante 1 min a 600 x g.
   3. Coloque 550 μL del sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 ml y centrífuga durante 1 min a 600 x g.
   4. Transfiera 400 μL del sobrenadante con 30 μL de proteinasa K a otro tubo de 1,5 ml.
   5. Agregue 400 μL de al tampón y use un mezclador de vórtice durante 15 s.
   6. Incubar a 70 °C durante 10 min.
   7. Añadir 400 μL de 96-100% de alcohol. Use un mezclador de vórtice durante 15 s.
   8. Transfiera 600 μL de mezcla a una columna de absorción y centrífuga durante 1 min a 13700 g. Cambie el tubo inferior. Repita este paso 11 veces.
   9. Añadir 500 μL de tampón AW1, centrifugar durante 1 min a 13.700 x g, y cambiar el tubo inferior.
   10. Añadir 500 μL de tampón AW2, centrifugar durante 3 min a 13.700 x g, y cambiar el tubo inferior.
   11. Centrífuga durante 3 min a 13.700 x g.
   12. Transfiera la mezcla a un nuevo tubo de 1,5 ml, agregue 200 μL de ATE tampón, incube a temperatura ambiente durante 5 min y centrífuga durante 1 min a 13.700 x g.
2. Pruebas de calidad. Use electroforesis en gel de sefarosa al 1% para probar la calidad. Añadir 400 ng de muestra, 120 V, 30 mins. Resultado ideal: Concentración de ADN: ≥ 10 ng/μL, pureza de ADN: A260/A280 = 1.8-2.0, ADN bruto: ≥ 300 ng.
3. Preparar las librerías utilizando un kit de secuenciación metagenómica 16S según el protocolo del fabricante.
   1. Realizar PCR. Brevemente, cada reacción de PCR de 25 μL contiene 12,5 ng de ADN de muestra como entrada, 12,5 μL de 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix y 5 μL de cada imprimación a 1 μM.
   2. Realizar PCR utilizando el siguiente protocolo: una etapa inicial de desnaturalización realizada a 95°C durante 3 min seguida de 25 ciclos de desnaturalización (95°C, 30 s), recocido (55°C, 30 s) y extensión (72°C, 30 s), y un alargamiento final de 5 min a 72°C.
   3. Limpie el producto de PCR de la mezcla de reacción con perlas magnéticas utilizando las instrucciones del fabricante.
   4. Repita los pasos 3.3.1 y 3.3.2.
   5. Pruebas de calidad. Consulte el paso 3.2.
   6. Repita el paso 3.3.3.
   7. Pruebas de calidad. Use electroforesis en gel de sefarosa al 1% para probar la impureza, un espectrofotómetro para probar la pureza, un fluorómetro para probar la concentración y un kit de ensayo de ARN para probar la integridad. Siga el protocolo del fabricante. Normalizar y agrupar las bibliotecas; luego secuencia (configuración de lectura de extremo pareado de 2 x 300 pb) utilizando celdas de flujo estándar V3 de ciclo de 600, produciendo aproximadamente 100,000 lecturas de base de extremo pareado 2 x 300.
      NOTA: Las secuencias de imprimación de longitud completa: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de amplicón 16S: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] y 16S Amplicon PCR Reverse primer: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].

4. Analizar los datos de secuenciación del gen 16S rRNA

1. Filtre las lecturas en bruto de cada muestra en función de la calidad de secuenciación con el paquete de software QIIME 2-201802²⁰.
   1. Copie tres archivos en el directorio: emp-paired-end-sequences_01
      un archivo forward.fastq.gz que contiene las lecturas de la secuencia de avance,
      un archivo reverse.fastq.gz que contiene la secuencia inversa lee,
      Un archivo Barcodes.fastq.gz que contiene el código de barras asociado lee
   2. Ejecutar
      importación de herramientas qiime \
      --escriba EMPPairedEndSequences \
      --input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
2. Retire las secuencias de imprimación y adaptador.
   qiime cutadapt recortado pareado \
   --i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
   --p-front-f GCTACGGGGGG \
   --p-front-r GCTACGGGGGG \
   --p-tasa de error 0 \
   --quality-cutoff 25 \
   --o-trimmed-sequences trimmed-seqs_03.qza \
   --detallado
3. Lecturas de secuencia acortadas en las que ambas cualidades de extremo pareado son inferiores a 25. Ver arriba --quality-cutoff 25
4. Analice los datos de secuenciación.
   1. Reúna secuencias para formar unidades taxonómicas operativas (OTU) con un límite de similitud del 97%.
      qiime vsearch dereplicate-sequences \
      --i-sequences trimmed-seqs_03.qza \
      --o-dereplicated-table table_04.qza \
      --o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
      ​
      qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
      --i-table table_04.qza \
      --i-sequences rep-seqs_04.qza \
      --i-reference-sequences 97_otus.qza \
      --p-perc-identity 0,97 \
      --o-clustered-table table-cr-97.qza \
      --o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
      --o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza
   2. Para las OTU, calcule la abundancia relativa en cada muestra. La información sobre la abundancia se encuentra en la tabla-cr-97.qza
5. Emplee un clasificador bayesiano nativo, que apunta al conjunto de entrenamiento RDP (versión 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), para ordenar todas las secuencias. La información del taxón mapeado se encuentra en la tabla-cr-97.qza
6. Dentro de la OTU dada, asigne una clasificación que refleje la mayor coherencia de las secuencias a las OTU. Luego, alinee las OTU. Ver table-cr-97.qza y rep-seqs-cr-97.qza
7. Sobre la base de la información del grupo de muestra, realice la diversidad alfa (incluidos los índices Chao 1, ACE, Shannon, Simpson y Evenness) y el análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en UniFrac.
   exportación de herramientas qiime \
   --input-path table-cr-97.qza \
   --output-path exported-feature-table
   exportado-característica-tabla
   
   qiime diversidad alfa \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-métrica observed_otus \
   --o-alfa-diversidad observed_otus_vector.qza
   
   qiime diversidad beta \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-métrica braycurtis \
   --o-distance-matrix unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

5. Predecir la función bacteriana

1. Para predecir la representación relacionada de las características de la bacteria, utilice BugBase²¹. La tabla OTU de entrada para BugBase se prepara mediante los siguientes comandos.
   biom convert -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
   biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
   NOTA: La predicción se basa en seis categorías de fenotipos (Ward et al. no publicados) (https://bugbase.cs.umn.edu/): tinción de Gram, tolerancia al oxígeno, capacidad para formar biopelículas, contenido de elementos móviles, patogenicidad y tolerancia al estrés oxidativo.
2. Predecir la composición funcional de un metagenoma por PICRUSt con el uso de datos de genes marcadores y una base de datos que contiene genomas de referencia²².
   make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
   normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
   predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
   categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
   categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt
3. Analizar las diferencias de funciones entre cada grupo con la ayuda de STAMP^23,24. Consulte las citas para operar el software.

6. Datos

1. Utilice software estadístico para calcular la significación de los hallazgos. La indicación de significación estadística debe establecerse como P < 0,05.
2. Evalúe las diferencias en edad y paridad por la prueba t de Student. Evaluar las diferencias en el estado menopáusica, los antecedentes de hipertensión y la diabetes mediante la prueba de chi cuadrado. Evaluar las diferencias en el número de taxones bacterianos ováricos mediante la prueba U de Mann-Whitney.

Resultados

Pacientes
Un total de 16 pacientes calificados fueron incluidos en el estudio. El grupo de control incluyó a 10 mujeres con un diagnóstico de tumor uterino benigno (entre ellas, 3 pacientes fueron diagnosticadas con mioma uterino y 7 pacientes fueron diagnosticadas con adenomiosis uterina). Mientras tanto, el grupo de cáncer contenía 6 mujeres con un diagnóstico de cáncer de ovario seroso (entre ellas, 2 pacientes fueron diagnosticadas con estadio II, y 2 de ellas fueron diagnosticadas con estadio III...

Discusión

El cáncer de ovario tiene una influencia notable en la fertilidad de las mujeres²⁵. La mayoría de las pacientes con cáncer de ovario se diagnostican en etapas tardías, y la tasa de supervivencia a 5 años es inferior al 30%¹⁸. Se ha publicado la confirmación de bacterias en las vísceras sólidas abdominales, incluyendo el hígado, el páncreas y el bazo. La existencia de bacterias en el tracto reproductivo femenino superior se produce porque el cuello uterino no está encerrado<...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2200 TapeStation Software	Agilgent Estados Unidos
AmpliSeq para la preparación, los índices y los accesorios de la biblioteca Illumina
Image-pro plus 7	Media Cybernetics
Leica ASP 300S	Leica Biosystems División de Leica Microsystems
Leica EG 1150	Leica Biosystems División de Leica Microsystems
Leica RM2235	Leica Biosystems División de Leica Microsystems
Anticuerpo monoclonal LPS Core, clon WN1 222-5	Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus perlas magnéticas	Omega Biotek	M1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit	Omega Biotek	M4029-01
MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Silva	Instituto Max Planck de Microbiología Marina y Universidad Jacobs
el sistema QuantiFluor dsDNA	Promega	E2670
Trimmomatic	Bjö rn Usadel
ZytoChem Plus (HRP) Kit Anti-Conejo (DAB) Sistemas	Zytomed	HRP008DAB-RB