Aquí describimos la adquisición óptica y la caracterización de potenciales de acción de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas utilizando un sistema de fotometría modular de alta velocidad.
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Artículo de método
Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las técnicas convencionales de microelectrodos intracelulares para cuantificar la electrofisiología de cardiomiocitos son extremadamente complejas, requieren mucha mano de obra y, por lo general, se llevan a cabo con bajo rendimiento. La expansión rápida y continua de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) presenta un nuevo estándar en la investigación cardiovascular y ahora se necesita métodos alternativos para aumentar el rendimiento de los datos electrofisiológicos a nivel de una sola célula. VF2.1Cl es un tinte sensible al voltaje recientemente derivado que proporciona una respuesta rápida de un solo canal y de alta magnitud a las fluctuaciones en el potencial de membrana. Posee una cinética superior a las de otros indicadores de tensión existentes y pone a disposición datos funcionales equivalentes a los de las técnicas tradicionales de microelectrodos. Aquí, demostramos una caracterización simplificada y no invasiva del potencial de acción en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC de ritmo externo utilizando un sistema de fotometría modular y altamente asequible.
Introducción
El modelado electrofisiológico de cardiomiocitos y la construcción de plataformas eficientes para el cribado de fármacos cardíacos es esencial para el desarrollo de estrategias terapéuticas para una variedad de trastornos arrítmicos. La rápida expansión de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha producido avances prometedores en el modelado de enfermedades humanas y la investigación farmacológica utilizando cardiomiocitos aislados derivados de pacientes (iPSC-CM). Las técnicas "estándar de oro" para la caracterización electrofisiológica de estas células a través de patch-clamp (current-clamp) pueden cuantificar la morfología y la duración del ....
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Protocolo
1. Preparaciones celulares
NOTA: Las iPSC humanas utilizadas en este protocolo se derivaron de donantes sanos y se diferenciaron en monocapas utilizando la modulación de moléculas pequeñas completamente definida de la señalización WNT y las técnicas de purificación de lactato como se describió anteriormente12,13,14. Los iPSC-CMs se mantuvieron cada 2-3 días con un medio de cultivo que se describe a continuación.
- Preparar un medio de cultivo de medio basal (RPMI 1640) y suplemento al 2% (B27). Conservar a 4 °C. Uso a temperatura ambiente ....
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Resultados
Figura 3: Perfiles de potencial de acción óptica (AP) de cardiomiocitos nativos aislados y cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC-CM). (A) AP óptico representativo de un solo cardiomiocito murino (centro) con media ± SEM de APD50 y APD90 (n = 7, derecha). (B) AP óptico representativo de un.......
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Discusión
Aquí describimos un protocolo básico para adquirir fácilmente perfiles AP detallados a partir de iPSC-CMs aislados adecuados para el modelado electrofisiológico y la detección de fármacos cardíacos. Detectamos AP regulares y robustos de nuestros iPSC-CMs escasamente sembrados, lo que sugiere tanto la funcionalidad del indicador como la fidelidad metodológica.
Debido al amplio espectro de metodologías comerciales para la reprogramación de iPSC y la falta de estandarización para los protocolos d.......
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Divulgaciones
Cairn Research Ltd apoyó esta publicación cubriendo los costos de producción del archivo de video.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Cairn Research Ltd. por su amable contribución financiera que cubrió los costos de producción de esta publicación. Además, agradecemos a la Sra. Ines Mueller y a la Sra. Stefanie Kestel por su excelente apoyo técnico.
La investigación de los autores está respaldada por el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 y bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania - EXC 2067/1- 390729940) y la Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25 tripsina EDTA | Gibco | ||
| Suplemento B27 | Gibco | ||
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucosa anhidra BioChemica | ITW Reactivos | A1422 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10270-106 | |
| Kit de potencial de membrana FluoVolt | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipino | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibidor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medio | Gibco | ||
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Cubreobjetos | |||
| , espesor 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | dispositivos | ||
| moleculares | Investigación de Cairn | ||
| Filtro de excitación ET470/40x | Tecnología | ||
| ET535/50m | Tecnología Chroma | ||
| Grabado Neubauer Hemacitómetro | Hausser Scientific | ||
| Cubos de Filtro | Investigación de Cairn | ||
| IX73 Microscopio invertido | Olimpo | ||
| Investigación de | mojones MonoLED | ||
| Adaptadores multipuerto | Investigación de Cairn | ||
| Estimulador de células Myopacer | Obturador IonOptix | ||
| Optomask | Investigación de Cairn | ||
| Controlador de sistema Optoscan | Cairn Research | ||
| PH-1 Plataforma de Temperatura Controlada | Warner Instruments | ||
| Detector de fotomultiplicadores | Investigación de Cairn | ||
| Inserto de amplificador PMT | Cairn Research | ||
| Inserto de suministro PMT | Cairn Research | ||
| RC-26G Cámara de baño abierta | Warner Instruments | ||
| Adaptador de etapa SA-OLY/2AL | Olimpo | ||
| T565lpxr Divisor de haz dicroico | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Controlador de temperatura de doble canal | npi Electrónico | ||
| UPLFLN 40X Objetivo | Olympus | ||
| Cámara a color USB 3.0 | Fuente | ||
| de imagenSoftware | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Dispositivos moleculares | ||
| Captura IC 2.4 | Fuente de imágenes | ||
| Prisma 8 | Gráfico |
Referencias
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al.
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Reimpresiones y permisos
