El ultrasonido de alta resolución puede ayudar a agilizar los experimentos que requieren ratones embarazadas cronometando al determinar el estado del embarazo, la edad gestacional y las pérdidas del embarazo. Aquí se presenta un protocolo para ilustrar métodos para evaluar embarazos de ratón, así como posibles escollos (artefactos de imagen) que pueden imitar el embarazo.
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Artículo de método
¿Está mi ratón embarazada? Evaluación de ultrasonido de alta frecuencia
En este artículo
Resumen
Resumen
El ratón es el modelo animal de mamífero de elección para muchas enfermedades humanas y procesos biológicos. La biología del desarrollo a menudo requiere ratones preñados por etapas para determinar los procesos evolutivos en varios momentos. Además, la cría óptima y eficiente de ratones modelo requiere una evaluación de los embarazos cronometines. Más comúnmente, los ratones se aparean durante la noche, y se determina la presencia de un tapón vaginal; sin embargo, el valor predictivo positivo de esta técnica es subóptimo, y hay que esperar para saber si el ratón está realmente embarazada. La biomicroscopia de ultrasonido de alta resolución es una herramienta efectiva y eficiente para la obtención de imágenes: 1) Si un ratón está embarazada; 2) Qué etapa gestacional ha alcanzado el ratón; y 3) Si hay pérdidas intrauterinas. Además de los embriones y fetos, el investigador también debe reconocer artefactos comunes en la cavidad abdominal para no confundirlos con un útero grávido. Este artículo proporciona un protocolo para la proyección de imagen junto con ejemplos ilustrativos.
Introducción
El ratón es el modelo de mamífero preferido para muchas enfermedades humanas y procesos biológicos1,2,3,4. La investigación en biología del desarrollo a menudo requiere ratones preñados por etapas para determinar los procesos evolutivos en varios puntos de tiempo5,6,7,8. Además, la cría óptima y eficaz de ratones modelo requiere una evaluación de los embarazos cronometivos, especialmente cuando los investigadores están estudiando los efectos de una mutación genética en el desarrollo. Por lo general, los investigadores se aparean con ratones heterocigotos durante la noche, buscan un tapón vaginal temprano a la mañana siguiente y esperan que se produce un embarazo9. La determinación de la pérdida intrauterina típicamente comienza con la comprobación de una camada recién nacida para las proporciones mendelianas de genotipos, luego trabajar hacia atrás mediante el sacrificio de ratones embarazadas en varias etapas gestacionales, y la recuperación de los embriones. Los investigadores pueden determinar el aumento de peso como una métrica de un embarazo positivo10,11; sin embargo, especialmente con ratones genéticamente modificados, las camadas pueden ser muy pequeñas y posteriormente reabsorbidas cuando hay pérdida intrauterina debido a que el aumento de peso puede no ser obvio (particularmente al principio del embarazo, ~ E6.5-8.5). Un ratón puede aparecer falsamente embarazada debido, por ejemplo, a un tumor abdominal benigno. En esencia, se trabaja "ciego".
La biomicroscopia de ultrasonido de alta resolución permite la visualización directa del útero grávido y el desarrollo de embriones de ratón12,13,14,15,16. Aunque inicialmente habíamos desarrollado métodos para evaluar la fisiología cardiovascular de ratón embrionario16,17,reconocimos la utilidad de esta modalidad de imagen para agilizar nuestra cría de ratones. Específicamente, ya no tuvimos que esperar para "ver" si un ratón estaba embarazada, basado en el aumento de peso obvio o el parto de una camada; podríamos determinar el estado grávido y volver a aparear ratones rápidamente si la presa no estaba embarazada. Además, las pérdidas intrauterinas también podrían ser fácilmente fotovidas, y se podría determinar una línea de tiempo de pérdida sin sacrificar el ratón (ver Figura 1 para un esquema). Así, se puede ahorrar tiempo, valiosos ratones modelo y fondos.
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Protocolo
Todos los pasos de este protocolo siguen la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud y han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York.
1. Apareamiento de ratones para embarazos cronomenales
- Aparee el ratón hembra apropiado (generalmente un heterocigoto) en una jaula con el ratón macho apropiado (generalmente un heterocigoto) para el apareamiento nocturno.
- Separe los ratones a la mañana siguiente. Alternativamente, aparearse continuamente con los ratones hembra y macho, aumentando así las posibilidades de embarazo.
NOTA: Sin embargo, un embarazo exactamente cronometero no se puede asegurar con la alternativa, y el estacionamiento de los embriones del ratón por ultrasonido no está claro, especialmente cuando el proceso de la enfermedad da lugar al retraso de crecimiento intrauterino. Si se supone que los embriones portadores de la variante genética son pequeños, busque los compañeros de camada de tipo salvaje más grandes para medir la edad gestacional.- Opcional: Busque el tapón vaginal. Si no hay tapón vaginal, la hembra del ratón no se ha apareado. Si hay un tapón vaginal, todavía es probable que la hembra de ratón no quede embarazada.
- Tiempo el día después del apareamiento durante la noche como E0.5.
- Realice imágenes en E6.5–E.8.5 para determinar el embarazo y vuelva a aparearse con los ratones si el ratón no está embarazada (consulte el paso 1.1).
NOTA: En esta etapa, la presa femenina no está obviamente embarazada del ojo; por lo tanto, la proyección de imagen del ultrasonido permite la determinación temprana y el re-acoplamiento.
2. Anestesia y preparación del ratón
- Coloque la ratón embarazada en la cámara de inducción anestésica.
- Mezcle el isoflurano con aire ambiente u oxígeno medicinal, a una concentración de 2%-3% a una velocidad de flujo de 1 L/min para inducir la sedación de la ratón embarazada en la cámara de inducción.
NOTA: La sedación ocurre típicamente dentro de 1-2 minutos. El ratón estará quieto, y su respiración se habrá ralentizado. - Transfiera rápidamente el ratón a la plataforma de imágenes. La plataforma de imágenes normalmente también tiene elementos de calefacción, lo que puede ayudar a mantener el mouse caliente.
- Coloque la nariz del ratón en la anestésica nosecona.
- Reenrute rápidamente la mezcla de isoflurano/oxígeno a la plataforma de imágenes nosecona. Mantener el isoflurano al 2%-3% a 1 L/min de flujo.
- Determine el nivel de sedación por pellizco de la pata, reflejo córneo, nivel de respiración, y cualquier movimiento.
NOTA: El reflejo corneal se puede determinar inicialmente mediante la aplicación de ungüento hidratante a los ojos para evitar que se sequen mientras el ratón está anestesiado (el ratón no cierra los ojos). - Con el ratón acostado en decúbito supino (en la parte posterior), pegue las patas a las almohadillas de electrocardiograma (ECG) de la plataforma de imágenes.
NOTA: Sin embargo, un EKG no es necesario para este tipo de imágenes. - Retire el pelaje del abdomen de la presa preñada de la siguiente manera:
- Moje bien el pelaje abdominal con etanol al 70%, incluso hasta los bordes laterales. No aplique tanto que haya escorrentía en la plataforma.
NOTA: El etanol funciona mejor como lubricante de afeitar que el agua. - Use la cuchilla de afeitar para afeitar cuidadosamente el abdomen. Tenga cuidado de no cortar los pezones.
- Limpie el pelaje afeitado del abdomen con gasa o algunas toallitas.
- Alternativamente, use una crema depilatoria después de usar los cortadores de piel para eliminar la mayor parte del pelaje.
- Moje bien el pelaje abdominal con etanol al 70%, incluso hasta los bordes laterales. No aplique tanto que haya escorrentía en la plataforma.
3. Imágenes transabdominales del (presunto) ratón preñado
- Después de afeitar el abdomen, reduzca el isoflurano a 1%-1.5%, manteniendo un caudal de 1 L/min. Controlar el nivel de sedación por el nivel de respiración y cualquier movimiento, así como el pellizco de la pata y / o reflejo corneal.
NOTA: La frecuencia cardíaca del ratón anestesiado normalmente será de 400–500/min, dependiendo de la temperatura del núcleo (rectal). Con el fin de un control rápido del embarazo, no caliente el ratón a una temperatura central fisiológica; la frecuencia cardíaca estará más cerca de 400-450/min, pero puede disminuir aún más con un ritmo irregular si el ratón se enfría con imágenes prolongadas.- Es importante destacar que asegúrese de que las respiraciones sean moderadas en profundidad y regularidad, no erráticas o agonales (jadeando: profundas, lentas y erráticas, con retracciones intercostales y subcostales profundas).
NOTA: La frecuencia respiratoria del ratón anestesiado no ventilado será típicamente de 60–100/min. Ver https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html y https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice.
- Es importante destacar que asegúrese de que las respiraciones sean moderadas en profundidad y regularidad, no erráticas o agonales (jadeando: profundas, lentas y erráticas, con retracciones intercostales y subcostales profundas).
- Aplique gel de ultrasonido (acoplamiento acústico) en el abdomen generosamente.
- Coloque el transductor de imágenes en el abdomen para orientarlo en un plano horizontal: oriente la sonda para obtener una orientación izquierda-derecha en el sistema de imágenes; el "punto" o cresta indicado en el lado de la sonda de imágenes debe estar orientado hacia la derecha.
NOTA: Deslizar la sonda de imágenes hacia la derecha del mouse debe cambiar la imagen correspondiente en el sistema de ultrasonido a la derecha del mouse (imagine mirar "hacia arriba" desde la cola del mouse, la derecha del mouse se dejará en el monitor).- Por lo general, utilice el sistema de montaje del transductor y el sistema de manipulador de rieles del sistema de imágenes. Aquí, se han utilizado imágenes de "mano libre" en las que el transductor de imágenes es de mano (dos manos son más firmes que una) y que permite movimientos más rápidos alrededor del abdomen. Estos movimientos, como se describirá a continuación, incluyen tanto los movimientos rotacionales como los de traslación. Sin embargo, esto requiere más práctica.
- Identificar la vejiga en la pantalla (Vídeo 1).
- Escaneando caudalmente desde la vejiga, identificar la vagina. Luego, escaneando lenta y suavemente en dirección craneal, identifique la bifurcación de la vagina en los cuernos uterinos izquierdo y derecho(Figura 2; Vídeo 1).
- Comenzar el estudio del útero (cuernos uterinos izquierdo y derecho)13 (Figura 3; Vídeo 2).
NOTA: Hasta mediados de la gestación (E10.5 o E11.5), los embriones de ratón se colocarán a lo largo de las periferias derecha e izquierda. A medida que crecen, las porciones más distales del útero y sus embriones correspondientes girarán hacia afuera y posteriormente. A medida que los embriones crecen más (E15.5 y más tarde, generalmente), los fetos de ratón se colocarán casi al azar en varias direcciones, y se hace difícil "rastrear" un útero de proximal a distal.- Escanee rápidamente simplemente para verificar si un ratón está embarazada o no. Este método rápido requiere solamente el reconocimiento de un útero grávido y de embriones del ratón.
- Alternativamente, tómese más tiempo para enumerar los embriones (vivos, muertos, reabsorbidos) en cada cuerno uterino.
NOTA: En general, un embrión vivo exhibirá órganos distintos como un corazón, extremidades, cabeza con ventrículos y ojos. Un embrión muerto adquiere una apariencia homogénea y "blanda" a menos que simplemente esté muerto. Los embriones reabsorbidos tienen una mancha ecogénica milimétrica en el centro de un útero de aspecto grávido (Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8). - Para determinar si un embrión está realmente vivo, busque el latido del corazón y/o el flujo sanguíneo.
NOTA: El mapeo de flujo Doppler color puede ayudar a determinar la presencia de flujo sanguíneo, tanto en el embrión como en el cordón umbilical. En general, esto puede aplicarse a embriones mayores de E8.5. - Reconocer artefactos potenciales que pueden imitar un útero grávido(Figura 9, Figura 10). Además, como el gas intestinal y otros artefactos de "sombra" de ultrasonido pueden oscurecer segmentos del cuerno uterino, realice la obtención de imágenes desde múltiples puntos de vista para garantizar una visualización adecuada del útero.
- Una vez completada la encuesta, limpie el gel del abdomen con gasa o toallitas. Trate de eliminar tanto como sea posible como el gel tiende a enfriar el ratón hacia abajo.
- Despele las patas, y retire el ratón de la nosecone anestésico.
- Mueva suavemente el ratón de nuevo en su jaula. Ella debe despertarse y comenzar a moverse dentro de un minuto más o menos.
NOTA: Los ratones modificados genéticamente pueden tardar un poco más en recuperarse de la anestesia y necesitan ser observados más de cerca.
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Resultados
Este protocolo permitirá a un investigador determinar con confianza si un ratón está embarazada, incluso durante las primeras etapas y determinar si hay pérdidas embrionarias o fetales prenatales obvias sin necesidad de sacrificar la presa embarazada. Este protocolo es especialmente útil cuando se crían ratones genéticamente modificados; típicamente, los cruces heterocigotos x heterocigotos para producir descendencia homocigótica conducen al fracaso del desarrollo adecuado, lo que causa letalidad prenatal.
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Discusión
El primer paso más importante en la proyección de imagen es identificar la vagina y después determinar la bifurcación del cuerno uterino a la izquierda y a la derecha. Al seguir cada cuerno uterino, es menos probable que el imager identifique erróneamente los bucles del intestino como el útero. Por otra parte, la comprensión de las variaciones en el aspecto del intestino (con/sin materia fecal) es importante distinguir éstos del útero; de vez en cuando, las "bolas" fecales en los bucles intestinales pueden imitar un úter...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| depilatoria | |||
| Etanol, 70% | |||
| Cortapieles Gasa | |||
| o KimToallitas | |||
| Isoflurano | |||
| Oxígeno médico (opcional) | |||
| Cinta | |||
| médicaSistema de imágenes para ratones (incluida la configuración de anestesia y la plataforma de imágenes) | Fujifilm Visual Sonics | Varios | Cualquier sistema con sonda de transductor de ultrasonido de frecuencia central de 40 MHz |
| Hoja de afeitar (no una maquinilla de afeitar de seguridad) | |||
| Báscula (para pesar ratón) | |||
| Gel |
Referencias
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