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Artículo de método

Establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular

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DOI:

10.3791/61897

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9 de noviembre de 2020

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1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza), Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX), Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

En este artículo

Resumen

Se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela, que combina polinizaciones de campo y laboratorio y observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia con la identificación de genotipos Spor PCR y el monitoreo de la floración para la selección de polinizadores.

Resumen

Los cultivares de ciruela japonesa comúnmente cultivados son híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el Prunus salicina original con otras especies de Prunus. La mayoría de los híbridos exhiben autoincompatibilidad gametofítica, que está controlada por un locus Súnico y altamente polimórfico que contiene múltiples alelos. La mayoría de los híbridos cultivados son autoincompatibles y necesitan polen de un donante compatible para fertilizar sus flores. El establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa es cada vez más importante debido al alto número de nuevos cultivares con requisitos de polinización desconocidos. En este trabajo, se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela. La autocompatibilidad se determina mediante polinizaciones manuales tanto en el campo como en el laboratorio, seguidas de un monitoreo del alargamiento del tubo polínico con microscopía de fluorescencia y también un monitoreo de la maduración de la fruta en el campo. La selección de cultivares polinizadores se evalúa combinando la identificación de genotipos Smediante análisis PCR con el seguimiento del tiempo de floración en campo. Conocer los requerimientos de polinización de los cultivares facilita la selección de cultivares para el diseño de nuevos huertos y permite la detección temprana de problemas de productividad relacionados con la deficiencia de polinización en huertos establecidos.

Introducción

La ciruela japonesa(Prunus salicina Lindl.) es originaria de China1. En elsiglo 19, este cultivo se introdujo desde Japón a los Estados Unidos, donde se cruzó con otras ciruelas diploides de América del Norte2. En elsiglo 20, algunos de estos híbridos se extendieron a regiones templadas de todo el mundo. Hoy en día, el término "ciruela japonesa" se refiere a una amplia gama de híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el original P. salicina con hasta otros 15 Prunus diploides spp.3,4,5.

La ciruela japonesa, al igual que otras especies de la familia Rosaceae, exhibe autoincompatibilidad gametofítica (GSI), que está controlada por un locus Súnico y altamente polimórfico que contiene múltiples alelos6. El locus Scontiene dos genes que codifican una ribonucleasa(S-RNasa)expresada en el pistilo, y una proteína F-box (SFB) expresada en el grano de polen7. En la reacción de autoincompatibilidad, cuando el alelo Sexpresado en el grano de polen (haploide) es el mismo que uno de los dos expresados en el pistilo (diploide), el crecimiento del tubo polínico a través del estilo se detiene debido a la degradación del ARN del tubo polen por la acción de la S-RNasa8. Dado que este proceso impide la fertilización del gametofito femenino en el óvulo, GSI promueve el cruce entre cultivares.

Aunque algunos cultivares de ciruela japonesa son autocompatibles, la mayoría de los cultivares que se cultivan actualmente son autoincompatibles y necesitan polen de donantes intercompatibles para fertilizar sus flores3. En las especies de frutas de hueso del género Prunus como la almendra9,el albaricoque10,11,12 y la cereza dulce13,los requisitos de polinización de los cultivares se pueden establecer mediante diferentes enfoques. La auto(in)compatibilidad puede determinarse mediante la autopolinización de flores en el campo y el posterior monitoreo del cuajado de la fruta, o mediante autopolinizacións semi-in vivo en condiciones controladas en un laboratorio y la observación de tubos de polen bajo el microscopio14,15,16,17,18 . Las relaciones de incompatibilidad entre cultivares pueden determinarse mediante polinizaciones cruzadas en el campo o en el laboratorio utilizando polen del cultivar polinizador potencial, y mediante la identificación de alelos Sde cada cultivar mediante análisis de PCR14,15,16,19,20,21,22 . En especies como la cereza dulce o la almendra, la auto(in)compatibilidad también se puede evaluar mediante la identificación de alelos S particulares asociados a la autocompatibilidad, como S4' en cereza dulce13 o Sf en almendra23.

Varios programas de mejoramiento de ciruelas de los principales países productores están liberando una serie de nuevos cultivares2,14,muchos de ellos con requisitos de polinización desconocidos. En este trabajo, se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela. La auto(in)compatibilidad está determinada por autopolinizaciones tanto en el campo como en el laboratorio, seguidas de observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia. La selección de cultivares polinizadores combina la identificación de genotipos Smediante análisis PCR con el seguimiento del tiempo de floración en campo.

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Protocolo

1. Polinización manual en el campo

  1. Extracción de polen
    1. Para obtener polen, recolectar capullos florales en la etapa D24,de acuerdo con la etapa 57 en la escala BBCH25,26.
      NOTA: Se necesitan más capullos florales en la ciruela japonesa que en otras especies de Prunus porque sus anteras producen menos polen.
    2. Retire las anteras con una malla de plástico (tamaño de poro de 2 mm x 2 mm) y colóquelas en papel a temperatura ambiente durante 24 h hasta la dehiscencia de la antera.
    3. Tamizar los granos de polen a través de una malla fina (0,26 mm x 0,26 mm de tamaño de poro), y conservarlos en un tubo de vidrio de 10 ml con una tapa a 4 °C hasta su uso.
  2. Polinización de flores castradas
    1. Cuando entre el 10% y el 20% de las flores estén abiertas, seleccione y etiquete varias ramas. Retire las flores abiertas y los brotes jóvenes, dejando solo los capullos florales en la etapa D24,según la etapa 57 en la escala BBCH25,26.
    2. Retire los pétalos, sépalos y estambres de entre 800 y 1,000 capullos de flores por tratamiento con uñas o pinzas.
    3. Polinizar a mano los pistilos con la ayuda de un pincel fino 24 h después de la castración. Algunas ramas contienen la mitad de los pistilos con polen del mismo cultivar, y la otra mitad con polen compatible de otro cultivar como control. Tenga cuidado de no contaminar la punta de los dedos o el pincel con granos de polen de otros cultivares.
    4. Registre los recuentos semanales de flores y frutos en desarrollo para caracterizar el patrón de caída de la fruta y cuantificar el conjunto final de la fruta en cada tratamiento de polinización.
  3. Polinización suplementaria en el campo
    1. Unos días antes de que se abran las primeras flores, encier los árboles seleccionados en una jaula de malla de 0,8 mm para evitar la llegada de insectos polinizadores.
    2. Cuando el 10%-20% de las flores están abiertas, seleccione y etiquete varias ramas por tratamiento de polinización, dejando de 1,000 a 1,500 flores por tratamiento.
    3. Al día siguiente, cuando las flores estén abiertas, polinizar cada flor con la ayuda de un pincel con el polen correspondiente (polen del mismo cultivar para la autopolinización, y de otros cultivares compatibles como control de polinización cruzada).
    4. Polinizar cada dos días hasta que todas las flores se abran.
    5. Registre los recuentos semanales de flores y frutos en desarrollo desde la antesis hasta la cosecha para caracterizar el patrón de caída de la fruta y cuantificar el cuajado final de la fruta en cada tratamiento de polinización.

2. Polinizaciones manuales en el laboratorio

  1. Recolectar de 50 a 100 flores en la etapa D24,de acuerdo con la etapa 57 en la escalaBBCH 25,26.
  2. En el laboratorio, castrar 30 flores por tratamiento (autopolinización y polinización cruzada).
    NOTA: La emasculación debe procederse con cuidado para evitar cualquier daño en los pistilos.
  3. Haga un corte fresco en la base de cada pedicelo de flores bajo el agua antes de colocarlo en un trozo de espuma de floristería húmeda (una pieza de espuma para cada tratamiento de polinización).
  4. Polinizar a mano cada pistilo 24 h más tarde utilizando un pincel fino con polen recogido previamente (ver sección 1.1). Polinizar un conjunto de pistilos con polen del mismo cultivar, y el otro conjunto con polen de un cultivar compatible como control.
  5. Dejar los pistilos polinizados 72 h después de la polinización a temperatura ambiente. La espuma floral debe estar continuamente húmeda con agua.
  6. Fije los pistilos en una solución fijadora de etanol/ácido acético (3:1) durante al menos 24 h a 4 °C. Reemplace el fijador con etanol al 75%. Las muestras se pueden conservar en esta solución a 4 °C hasta su uso27.
    NOTA: Asegúrese de que las muestras estén completamente sumergidas en la solución.

3. Observaciones microscópicas

  1. Evaluación de la germinación del polen in vitro
    1. Para elaborar el medio de germinación del polen, disuelva 25 g de sacarosa sobre 250 ml de agua destilada, luego agregue 0,075 g de nitrato de calcio [Ca(NO3)2] y 0,075 g de ácido bórico (H3BO3).
    2. Añadir 2 g de agar a la solución y mezclar hasta que se disuelva completamente28.
    3. Para esterilizar el medio, autoclave a 120 °C durante 20 min. Enfríe el medio y, antes de que se solidifique, distribuya 3 ml por placa de Petri estéril (55 mm x 12 mm) en una campana de flujo laminar estéril. Después de la solidificación media, conservar las placas de Petri envueltas en papel de aluminio a 4 °C hasta su uso.
    4. Esparce el polen de cada cultivar utilizado anteriormente como donante de polen en las polinizaciones controladas en dos placas de Petri e incube a 25 °C durante 24 h.
      NOTA: Los medios de cultivo inoculados se pueden observar con microscopía inmediatamente después o almacenarse a -20 °C hasta su uso. Para este propósito, las placas de Petri deben cambiarse del congelador al refrigerador 24 h antes de las observaciones de microscopía.
    5. Para observar los granos de polen, prepare una solución azul de anilina al 1% (v / v) que tiñe la callosa. Primero, prepare una solución tribásica de fosfato de potasio0.1 N(K 3 PO4)disolviendo 7.97 g de K3PO4 en 1,000 mL de agua destilada. Para elaborar la solución de azul de anilina al 1% (v/v), disuelva 1 ml de azul de anilina en 100 ml de 0,1 N K3PO4.
    6. Agregue 2-3 gotas de solución azul de anilina a cada placa de Placa de Petri y observe después de 5 minutos bajo un microscopio de epifluorescencia UV utilizando el filtro excitador BP340-390 y el filtro de barrera LP425. Cuente los granos de polen viables y no viables en tres campos por placa, cada campo contiene 100-200 granos de polen, en dos placas de Petri para cada cultivar.
  2. Crecimiento del tubo de polen
    1. Enjuague los pistilos fijos con agua destilada tres veces (1 h cada uno, 3 h en total) y transfiera al 5% (p/v) de sulfito de sodio (Na2SO3)a 4 °C durante 24 h. Para preparar esta solución, disuelva 5 g de sulfito de sodio en 100 ml de agua destilada.
    2. Autoclave los pistilos a 120 °C durante 8 min en sulfito de sodio al 5% (p/v) para ablandar los tejidos.
    3. Pistilos suavizados de calabaza en una gota de solución azul de anilina al 1% (v / v) debajo de un vidrio de cubierta en un portaobjetos para teñir la callosa.
    4. Observe el crecimiento del tubo polen a lo largo del estilo bajo un microscopio con epifluorescencia UV utilizando el filtro excitador BP340-390 y el filtro de barrera LP425.

4. Determinación de las relaciones de incompatibilidad

  1. Extracción de ADN de las hojas
    1. Para extraer adn, recolecte de 3 a 4 hojas jóvenes de cada cultivar en el campo, preferiblemente en primavera.
      NOTA: El ADN también se puede extraer de hojas maduras, pero el ADN de hojas jóvenes tiene menos compuestos fenólicos.
    2. Aísle el ADN utilizando un kit comercial y siga el kit de protocolo proporcionado (consulte la Tabla de materiales).
    3. Cuantificar la concentración de ADN y evaluar la calidad del ADN de cada muestra a 260 nm en un espectrofotómetro de microvolumen UV-Vis. Ajustar la concentración de ADN a 10 ng/μL.
  2. Condiciones de PCR para la amplificación de fragmentos
    1. Etiquete los tubos y tapas de PCR de 0,2 ml.
    2. Preparar los reactivos de PCR según la Tabla 1 y dejar que se descongelen sobre hielo.
    3. Configure un volumen de mezcla maestra de cada par de cebadores en un microtubo de 1,5 ml de acuerdo con el número de reacciones más el 10% del exceso, considerando un volumen de 16 μL por reacción. Añadir los reactivos siguiendo el orden de la Tabla 1 y mezclar bien.
    4. Alícuota 16 μL de mezcla maestra en cada tubo pcr de 0,2 ml que contenga 4 μL de plantilla de ADN o 4 μL de agua destilada esterilizada como control negativo (C-). Utilizar ADN de cultivares con genotipo conocido como controles positivos. Mezclar suavemente, cerrar los tubos de reacción con las tapas y centrifugar a 2.000 x g durante 30 s para recoger todo el volumen en la parte inferior del tubo de reacción.
    5. Coloque los tubos de reacción en el termociclador y configure el programa de PCR utilizando el siguiente perfil de temperatura: un paso inicial de 3 min a 94 °C, 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 56 °C y 3 min a 72 °C, y un paso final de 7 min a 72 °C20.
  3. Electroforesis y estimación del tamaño del fragmento
    1. Para preparar un mini gel de agarosa al 1,7% (p/v), disuelva 0,68 g de agarosa y 40 ml de tampón 1x TBE en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Derretir la solución calentando en un microondas a 600 W a intervalos de 30 s para evitar la ebullición.
    2. Deje que la solución permanezca en el banco para enfriarse y luego agregue 3.5 μL de solución de tinción de ácido nucleico.
    3. Coloque la bandeja de gel en el soporte de fundición y coloque el peine seleccionado en el molde de gel. Asegúrese de tener suficientes pozos para cada producto de PCR y escalera de ADN.
    4. Vierta la solución de agarosa en el molde de gel y deje que se enfríe hasta la polimerización. Retire el peine del gel polimerizado. Coloque el gel en el sistema de electroforesis horizontal que contenga suficiente tampón TBE 1x para cubrir la superficie del gel.
    5. Cargue el primer y último pozo con 2 μL de la escalera de peso molecular de ADN (escalera de ADN de 1 kb). Cargar 3 μL de cada producto de la PCR en los otros pozos. Cierre la cámara, encienda la alimentación y haga funcionar el gel a 100 V durante 30 minutos.
    6. Observe el gel bajo luz UV utilizando un sistema de documentación de gel. Utilice la escalera de peso molecular del ADN para determinar el tamaño del fragmento amplificado y compararlo con los controles positivos para identificar los alelos correspondientes.

5. Monitoreo de fechas de flores

  1. Monitorear la fenología de los diferentes árboles de cada cultivar en la floración durante diferentes años. Establezca la duración del período de floración desde la primera (aproximadamente 5%) hasta las últimas flores abiertas (aproximadamente 95%). La floración completa se considera cuando al menos el 50% de las flores están en la etapa F24,de acuerdo con la etapa 65 en la escala BBCH25,26.
  2. Para comparar las fechas de floración de los cultivares intercompatibles y determinar aquellas que coinciden en la época de floración cada año, elabore un calendario de tiempos de floración con datos de varios años.

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Resultados

Cada capullo de flor de ciruelo japonés contiene una inflorescencia con 1-3 flores. Al igual que en otras especies de frutas de hueso, cada flor se compone de cuatro verticilos: carpelo, estambres, pétalos y sépalos, que se fusionan formando una copa en la base de la flor. Las estructuras florales son más pequeñas que otras frutas de hueso, con un pistilo corto y frágil rodeado por los estambres que contienen una pequeña cantidad de granos de polen. En plena floración, las flores de cada inflorescencia aparecen separadas...

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Discusión

La metodología descrita en este documento para los requisitos de polinización de los cultivares de ciruela japonesa requiere determinar la auto(in)compatibilidad de cada cultivar mediante polinizaciones controladas en el campo o el laboratorio, y la posterior observación del crecimiento del tubo de polen con microscopía de fluorescencia. Las relaciones de incompatibilidad se establecen mediante la caracterización de los alelos Smediante genotipado molecular. Por último, la selección de polinizadores se realiza m...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 y RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón—Fondo Social Europeo, Unión Europea (Grupo Consolidado A12-17R), y Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT, 471839).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido Acético GlacialPanreac131008.1611
AgariNtRON Biotechnology25999
Azul de anilinaDifco8504-88
Ácido bórico (H3BO4)Panreac131015.1210
Nitrato de calcio 4-hidrato (Ca(NO3)2 &punto medio; 4H2O)Panreac131231.1211
CubreobjetosDeltalabD10246024 mm x 60 mm
Digital CameraImaging Developmet SystemsUI-1490SE
Digital Camera Software SuiteImaging Developmet Systems4.93.0.
ADN OligosThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM cada unoThermoSischer ScientificR0193
DreamTaq ADN polimerasaverde ThermoFisher ScientificEP0713
Etanol 96&grados;VWR-Chemicals83804.360
1Kb Escalera de ADN (Patente de EE. UU. No. 4.403.036) (500pb-12Kb)Invitrogen15615-016Tamaño: 250µ g; Conc: 1.0 y micro; g/µ l
Sistema de documentación de gelBio-Rad1708195
Contador de manoTamacoTM-4
Software de laboratorio de imágenesBio-RadSistema de análisis de imágenes para gel Sistema de documentación
MetaPhor AgaroseLonza50180
Microcentrífuga 5415 REppendorfZ605212
Microscopio con UV eflurescenciaLeicaDM2500Filtro excitador BP340-390, Filtro de barrera LP425
MicroportaobjetosDeltalabD10000426 mm x 76 mm
Mini Sistema de electroforesisFisherbrand14955170
MinicentrífugaThermoFisher Scientific15334204
NanoDrop 1000 EspectrofotómetroThermoFisher ScientificND1000
Placas de PetriDeltalab 20020155 mm x 14 mm
Fosfato de Potasio Tribásico (K3PO4· 1.5H2O)Panreac141513
Primer forward 'Pru C2'ThermoFisherScientific
Primer forward Pru T2'ThermoFisherScientific
Primer reverse 'PCER'ThermoFisherScientific
RedSafe Solución de tinción de ácidos nucleicosiNtRON Biotechnology21141
SacarosaPanreac131621.1211
Sulfito de sodio anhidro (Na2SO3)Panreac131717.1211
Speedtools kit de extracción de ADN vegetalBiotools21272
TBE Buffer (10X)PanreacA0972,5000PE
Termociclador T100Bio-Rad
Termomezclador confortEppendorfT1317
Autoclave vertical Presoclave IIJP Selecta4001725
VortexFisherbrand11746744
1861096

Referencias

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