Aislamiento de (micro) ARN fecal

Summary

Este protocolo aísla ARN total de alta calidad de muestras fecales de sujetos animales y humanos. Se utiliza un kit de aislamiento de miARN comercial con una adaptación significativa para aislar ARN puro con cantidad y calidad optimizadas. Los aislados de ARN son buenos para la mayoría de los ensayos de ARN aguas abajo, como la secuenciación, la micromatriz y la RT-PCR.

Abstract

Cada vez está más claro que el ARN existe en la luz intestinal y las heces en animales y humanos. El protocolo descrito a continuación aísla el ARN total, incluidos los microARN, de muestras fecales de sujetos animales y humanos. El objetivo es aislar el ARN total con alta pureza y cantidad para análisis posteriores como secuenciación de ARN, RT-PCR y microarray. Las ventajas de este protocolo optimizado en el aislamiento de miARN son la capacidad de aislar productos de ARN altamente purificados con pasos de lavado adicionales descritos, una mayor cantidad de ARN obtenida con un método mejorado en la resuspensión de la muestra y consejos importantes de descontaminación. Una limitación es la incapacidad de procesar y purificar muestras más grandes de más de 200 mg, ya que estos tamaños de muestra causarían una dificultad en la formación clara de la interfase. En consecuencia, el gran tamaño de la muestra puede contaminar la fase acuosa a extraer como se describe en el protocolo con materias orgánicas que afectan la calidad del ARN aislado al final. Sin embargo, los aislados de ARN de una muestra de hasta 200 mg son suficientes para la mayoría de los análisis posteriores.

Introduction

El ARN extracelular está siendo reconocido como un factor significativo que media muchos procesos biológicos¹. El ARN extracelular en las heces fue reportado por primera vez en 2008 como un marcador de cáncer de colon y colitis ulcerosa activa², y recientemente se reveló como un componente normal de la luz intestinal y las heces y media las comunicaciones huésped-microbio ^3,4,5. El propósito de este protocolo de aislamiento de ARN es extraer ARN extracelular de alta calidad de muestras fecales recolectadas de sujetos animales y ....

Protocol

Todos los métodos que involucran animales de investigación descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital Brigham and Women's, Escuela de Medicina de Harvard.

Todos los métodos que involucran sujetos de investigación humanos descritos aquí están de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Investigación Humana de Partners.

1. Recogida de muestras fecales

1. Autoclave o preparar un tubo de microcentrífuga estéril y libre de nucleasas de 2 ml con tapón de rosca para cada sujeto animal en un experimento.
   1. Para sujetos humanos, p....

Results

Se aislaron ARN representativos de muestras fecales de ratón de 50 mg (2 gránulos fecales de ratón) y 100 mg de muestras de heces humanas respectivamente y se eluyeron en agua libre de nucleasas de 50 μL. El análisis espectrofotómetro de la concentración sugiere que se aisló una cantidad total de 49 μg y 16 μg de ARN respectivamente (Tabla 1). La pureza del ARN fue alta como lo indica una relación A260 / A280 de ~ 2.0 y una relación A260 / A230 de ~ 1.8 (Tabla 1). Como se informó

Discussion

Es importante utilizar la técnica libre de RNasa para prevenir la contaminación por RNasa durante el aislamiento⁷. Después de la centrifugación y la formación de una interfase compacta, es clave evitar la interfase, la fase inferior y el contaminante de partículas flotando en la parte superior de la fase acuosa al recuperar la fase acuosa. Además, se agregan dos pasos de lavado con solución de lavado 2/3 de 500 μL y 250 μL para eliminar los contaminantes en la membrana del filtro y optimizar la ca.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido-fenol: cloroformo, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Guantes Thermo Fischer Scientific	14190-144
Microcentrífuga
mirVana Kit de aislamiento de miARN	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Tubos de microcentrífuga sin nucleasas (1,5 mL, 2 mL)
Agua sin nucleasas (no tratada con DEPC)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipeta sin ni puntas de pipeta sin nucleasas (con filtro)
Homogeneizador PowerLyzer 24	QIAGEN	13155
RNaseZap Solución de descontaminación de ARNasa	Thermo Fischer Scientific	AM9780
			de vórtice