Se ha implicado que diferentes regiones cerebelosas desempeñan un papel en distintos resultados conductuales, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. Este trabajo describe un método para diseccionar de manera reproducible y rápida la corteza cerebelosa de los hemisferios, las regiones anterior y posterior del vermis y los núcleos cerebelosos profundos con el fin de sondear las diferencias moleculares mediante el aislamiento del ARN y la prueba de las diferencias en la expresión génica.
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Artículo de método
Disección regional cerebelosa para análisis molecular
En este artículo
Resumen
Resumen
El cerebelo juega un papel importante en varias funciones clave, incluido el control del movimiento, el equilibrio, la cognición, la recompensa y el afecto. Los estudios de imágenes indican que las distintas regiones cerebelosas contribuyen a estas diferentes funciones. Los estudios moleculares que examinan las diferencias cerebelosas regionales están rezagados, ya que se realizan principalmente en extractos cerebelosos enteros, enmascarando así cualquier distinción en regiones cerebelosas específicas. Aquí describimos una técnica para diseccionar de manera reproducible y rápida cuatro regiones cerebelosas diferentes: los núcleos cerebelosos profundos (DCN), la corteza cerebelosa vermal anterior y posterior y la corteza cerebelosa de los hemisferios. La disección de estas distintas regiones permite la exploración de los mecanismos moleculares que pueden subyacer a sus contribuciones únicas al equilibrio, el movimiento, el afecto y la cognición. Esta técnica también se puede utilizar para explorar las diferencias en la susceptibilidad patológica de estas regiones específicas en varios modelos de enfermedad de ratón.
Introducción
El cerebelo contiene más de la mitad de las neuronas en el cerebro e históricamente se ha referido como un centro de control motor y equilibrio en el cerebro1. Más recientemente, los estudios han demostrado que el cerebelo juega un papel clave en varias otras funciones, incluida la cognición, el procesamiento de recompensas y afectana 2,3,4,5.
El cerebelo tiene una anatomía bien descrita: la región de la corteza está compuesta de gránulos, Purkinje y capas moleculares. Las células granulare....
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Protocolo
1. Configuración
- Reúna el equipo necesario, incluidas las tijeras de decapitación, las yempadoras romas, las tijeras de disección, las tijeras vasculares, la microespatula, la matriz cerebral del ratón sagital, las cuchillas de afeitar, las puntas de pipeta de 200 μL, la placa de Petri de vidrio, el portaobjetos de vidrio y el cubo de hielo. Coloca todo el equipo en una almohadilla absorbente.
- Coloque la placa de Petri, la placa de vidrio y la matriz cerebral sobre hielo.
- Usando una cuchilla de afeitar en un ángulo perpendicular, recorte aproximadamente 5 mm de la punta de una punta de pipeta de 200 μL. Esto hace que el t....
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Resultados
Para estos experimentos, se utilizaron cuatro ratones salvajes hembra de once semanas de edad tipo C57 / Black6. Se utilizó un ratón para realizar una disección cerebelosa completa que se conoce como "cerebelo a granel" y permitió la comparación de los niveles de ARN en regiones disecadas con una disección completa. Los otros tres ratones se utilizaron para realizar la disección cerebelosa descrita en este protocolo. El uso de tres ratones permite garantizar que las tendencias detectadas .......
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Discusión
El método descrito aquí permite evaluar la expresión génica subyacente y los mecanismos moleculares dentro de cuatro regiones cerebelosas distintas: los núcleos cerebelosos profundos (DCN), la corteza cerebelosa anterior del vermis (CCaV), la corteza cerebelosa posterior del vermis (CCpV) y la corteza cerebelosa de los hemisferios (CCH). La capacidad de evaluar estas regiones por separado ampliará nuestro conocimiento de la heterogeneidad de regiones cerebelosas específicas y posiblemente arrojará luz sobre su contribuci.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Austin Ferro y Juao-Guilherme Rosa en el laboratorio de Cvetanovic por su ayuda en la resolución de problemas de disecciones y en la extracción de ARN y RTqPCR. Esta investigación está financiada por M. Cvetanovic, R01 NS197387; | del HHS Institutos Nacionales de Salud (NIH).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1.5 Tubos de microcentrífuga | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Alcohol isopropílico | VWR Ciencias de la vida | 1106C361 | |
| 200 ul Puntas de pipeta | GeneMate | P-1237-200 | |
| Ratón adulto Cerebro Matrix Sagital | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S Pinzas | |
| romas | |||
| Cloroformo | Macron | 220905 | |
| Tijeras de decapitación Tijeras | |||
| disección | |||
| Alcohol etílico | Pharmco | 111000200 | |
| portaobjetos de vidrio (para electroforesis) | Homogeneizador BIORAD | ||
| Cubo | |||
| Jeringa de insulina (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv kit de ADNc para RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Espátula | |||
| Pinzas | |||
| Placa de Petri | Pyrex | ||
| Primetime Primer para Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Imprimación Primetime para Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Imprimación Primetime para Parvalbúmina | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Imprimación Primetime Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Cuchillas Rzor de un solo filo | Personna GEM | ||
| Morteros estériles de uso selecto | Reactivo FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol | Ambion de Life technologies | 15596018 | |
| Tijeras vasculares |
Referencias
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the....
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Reimpresiones y permisos
