Aquí se presenta un protocolo para administrar oligonucleótidos como ARN de interferencia pequeña (siRNA), imitadores de microARN (miR) o anti-micro-ARN (anti-miR) en adipocitos maduros para modular la expresión de proteínas y microARN.
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Artículo de método
Un modelo de cultivo celular de adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y microARN en la función de los adipocitos
En este artículo
Resumen
Resumen
La alteración de la función de los adipocitos contribuye a la patogénesis de enfermedades metabólicas como la diabetes tipo 2 y la resistencia a la insulina. Esto pone de relieve la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la disfunción de los adipócitos para desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades relacionadas con la obesidad. Modular la expresión de proteínas y micro-ARN en los adipocitos sigue siendo un gran desafío. Este artículo describe un protocolo para diferenciar los fibroblastos murinos en adipocitos maduros y para modular la expresión de proteínas y micro-ARN en adipocitos maduros a través de la transfección inversa utilizando oligonucleótidos de ARN de interferencia pequeña (siRNA) y micro-ARN imitador (miR mimic). Este protocolo de transfección inversa implica la incubación del reactivo de transfección y los oligonucleótidos para formar un complejo en la placa de cultivo celular al que se añaden los adipocitos maduros. Luego se permite que los adipocitos se vuelvan a unir a la superficie de la placa adherente en presencia del complejo oligonucleótidos / reactivo de transfección. Se pueden realizar análisis funcionales como el estudio de la señalización de insulina, la captación de glucosa, la lipogénesis y la lipólisis en los adipocitos maduros 3T3-L1 transfectados para estudiar el impacto de la manipulación de proteínas o microARN en la función de los adipocitos.
Introducción
La obesidad se considera un factor de riesgo importante para numerosas enfermedades metabólicas, incluida la resistencia a la insulina (RI), la diabetes tipo 2 (DT2) y las enfermedades cardiovasculares1. Las terapias actuales no han logrado detener la prevalencia en constante aumento de estas enfermedades, y el manejo de la RI de pacientes obesos y diabéticos sigue siendo un problema clínico importante. El tejido adiposo juega un papel crucial en el control de la homeostasis energética, y su expansión patológica durante la obesidad contribuye al desarrollo de IR y DT22,3. Esto pone de r....
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Protocolo
NOTA: Utilice técnicas estériles para realizar todos los pasos del protocolo en una campana de cultivo celular de flujo laminar. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los reactivos y equipos.
1. Diferenciación de fibroblastos murinos 3T3-L1 en adipocitos
- Cultivar los fibroblastos 3T3-L1 en platos de 100 mm en cultivo medio-DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de suero de ternero recién nacido, y 1% de penicilina y estreptomicina (Figura 1A). Coloque los platos en una incubadora de cultivo de tejidos (7% CO2 y 37 °C).
- Dos días despué....
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Resultados
Utilizando el procedimiento de transfección inversa descrito aquí para modular la expresión de proteínas o micro-ARN en adipocitos 3T3-L1, se ha demostrado que los adipocitos preservan su morfología después de la transfección(Figura 1B,C). De hecho, 2 días después de la transfección, los adipocitos estaban bien diseminados y unidos a la placa y presentaban gotas lipídicas multiloculares que son una característica de los adipocitos 3T3-L1 madu.......
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Discusión
Este trabajo presenta un protocolo detallado para la diferenciación y transfección de adipocitos maduros. Este método de transfección inversa es un método simple, económico y altamente eficiente para transfectar oligonucleótidos como, entre otros, siRNAs, imitadores de micro-ARN y anti-micro-ARN en adipocitos 3T3-L1, que es una de las líneas celulares más difíciles de transfectar. Este método tiene algunas limitaciones que deben considerarse. Este protocolo no es eficiente para la transfección con ADN plásmido, lo que li.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el INSERM, la Université Côte d'Azur y la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) a través del programa Inversiones para el futuro Laboratorio de Excelencia (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Iniciativa de Excelencia (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. cuenta con el apoyo de subvenciones de la Société Francophone du Diabète (SFD), la Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), el Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) y la Fondation Benjamin-Delessert. J.G. cuenta con el apoyo de ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. cuenta con el apoyo de la subvención ANR ADIPOPIEZO-19-CE14....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos | Dutscher 353043 | ||
| 2,5% de tripsina (10x) | Gibco | 15090-046 | diluido a 5x con D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Piscina no objetivo | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Colágeno tipo I de piel de becerro | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Medio de Águila Modificado (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4,5 g/L de D-glucosa; L-glutamina; no Etanol de piruvato |
| Sigma | 51976 | ||
| negativo marcado con FAM si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10270-106 | |
| Reactivo de glicerol libre | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Solución estándar de glicerol | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| Anticuerpo | HSP90Santa Cruz | sc-131119 | Dilución: 0.5 y micro; g/mL |
| Medio Esencial Mínimo Mejorado (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulina Recombinante Humana | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA imita | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Ensayos Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primeros ensayos Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Kit de PCR Verde | Qiagen | 219073 | |
| Suero para terneros recién nacidos | Gibco | 16010-159 | |
| Aceite Rojo O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Ratón Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Descubrimiento | L-056623-01-0005 | |
| Penicilina y estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Anticuerpo de perilipina-1 | Señalización celular | 3470 | Dilución: 1/1000 |
| Placa de Petri 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB anticuerpo | Señalización celular | 9272 | Dilución: 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 anticuerpo | Célula Señalización | 9275 | Dilución : 1/1000 |
| Rosiglitazona | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Reactivo de transfección (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulina anticuerpo | Sigma aldrich | T6199 | Dilución : 0,5 µ g/mL |
| anticuerpo Vamp2 | R& D Sistemas | MAB5136 | Dilución : 0,1 y micro; g/mL |
Referencias
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E.
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Reimpresiones y permisos
