Muestreo y procesamiento del cepillado nasal mediante videomicroscopía ciliar digital de alta velocidad: adaptación para la pandemia de COVID-19

Summary

Para garantizar un análisis funcional ciliar exitoso y de alta calidad para el diagnóstico de PCD, es esencial un método preciso y cuidadoso para el muestreo y procesamiento del epitelio respiratorio. Para continuar brindando el servicio de diagnóstico de PCD durante la pandemia de COVID-19, el protocolo de videomicroscopía ciliar se ha actualizado para incluir medidas adecuadas de control de infecciones.

Abstract

La discinesia ciliar primaria (DCP) es una ciliopatía móvil genética, que conduce a una enfermedad otosinopulmonar significativa. El diagnóstico de PCD a menudo se pasa por alto o se retrasa debido a los desafíos con diferentes modalidades de diagnóstico. La videomicroscopía ciliar, que utiliza videomicroscopía digital de alta velocidad (DHSV), una de las herramientas de diagnóstico para PCD, se considera el método óptimo para realizar el análisis funcional ciliar (CFA), que comprende la frecuencia de latido ciliar (CBF) y el análisis de patrón de latido (CBP). Sin embargo, DHSV carece de un procedimiento operativo estandarizado y publicado para procesar y analizar muestras. También utiliza epitelio respiratorio vivo, un importante problema de control de infecciones durante la pandemia de COVID-19. Para continuar brindando un servicio de diagnóstico durante esta crisis sanitaria, se ha adaptado el protocolo de videomicroscopía ciliar para incluir medidas adecuadas de control de infecciones.

Aquí, describimos un protocolo revisado para el muestreo y el procesamiento de laboratorio de muestras respiratorias ciliadas, destacando las adaptaciones realizadas para cumplir con las medidas de control de infecciones por COVID-19. Se describen los resultados representativos de CFA de muestras de cepillado nasal obtenidas de 16 sujetos sanos, procesadas y analizadas de acuerdo con este protocolo. También ilustramos la importancia de obtener y procesar tiras ciliadas epiteliales de calidad óptima, ya que las muestras que no cumplen con los criterios de selección de calidad ahora permiten CFA, lo que podría disminuir la confiabilidad diagnóstica y la eficiencia de esta técnica.

Introduction

La discinesia ciliar primaria (DCP) es una ciliopatía móvil heterogénea hereditaria, en la que los cilios respiratorios son estacionarios, lentos o discinéticos, lo que lleva a un aclaramiento mucociliar alterado y a una enfermedad oto-sino-pulmonar crónica 1,2,3,4. Las manifestaciones clínicas de la DCP son tos húmeda crónica y congestión nasal crónica a partir de la primera infancia, infecciones recurrentes o crónicas del tracto respiratorio superior e inferior que conducen a bronquiectasias, otitis media recurrente o crónica y sinusitis

Protocol

Se obtuvo la aprobación del comité de ética del hospital de Lieja y del Departamento de Higiene y Protección de la Salud en el Trabajo de la Universidad.

1. Muestreo de epitelio ciliado respiratorio

1. Asegúrese de que los sujetos estén libres de infección durante al menos 4-6 semanas, y libres de medicamentos nasales e inhalados, antes de la toma de muestras.
2. Preparar la preparación suplementada de M199: Suplemento medio de cultivo celular 199 (M199) (500 ml) con solución antibiótica (5 ml de estreptomicina/penicilina (50 μg/ml)) y solución antimicótica (5 ml de anfotericina B (2,5 μg/ml)).
3. Prepare 2 (uno para ca....

Results

Para ilustrar la eficacia de la técnica, presentamos los resultados de la CFA en una serie de 16 voluntarios adultos sanos (5 varones, rango de edad 22-54 años).

Las muestras de cepillado nasal de 14 (4 hombres, rango de edad 24-54 años) del total de 16 voluntarios proporcionaron suficientes bordes epiteliales apropiados que cumplieron con los criterios de selección necesarios para realizar CFA. De estas 14 muestras de cepillado nasal, se registraron un total de 242 bordes ciliados, y 212 bord.......

Discussion

Este documento tiene como objetivo proporcionar un procedimiento operativo estándar para CFA utilizando muestras de cepillado nasal, con ajustes realizados para las consideraciones apropiadas de control de infecciones durante la pandemia de COVID-19. El diagnóstico de PCD es desafiante, y actualmente requiere un panel de diferentes pruebas de diagnóstico, de acuerdo con la recomendación internacional, incluida la medición nasal de óxido nítrico, CFA usando DHSV, análisis ultraestructural ciliar usando microscopía electró.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos cónicos de 15 ml	FisherScientific	352096	Polipropileno de alta claridad de 15 ml Tubo cónico con tapa
Anfotericina B	LONZA	17-836E	Solución antifúngica
Pinza nasal de Blakesley-weil	NOVO SURGICAL	E7739-12	Se utiliza para sujetar el cepillo para realizar el cepillado nasal Cepillo
citología bronquial	CONMED	129	Se utiliza para la cepillado
Bastoncillo de algodón	NUOVA APTACA	2150/SG	Se utiliza para las pruebas de COVID-19
Cámara de videomicroscopía digital de alta velocidad	IDTeu Innovación en movimiento	CrashCam Mini 1510
Portaobjetos de vidrio	ThermoScientific	12372098	Portaobjetos de microscopio utilizados para crear la cámara de visualización
Caja calefactada	Células IBIDI en foco	10918	Se utiliza para calentar el muestra
Microscopio de luz invertida	Zeiss	AXIO Vert.A1
Calentador de lente	TOKAI HIT	TPiE-LH	Se utiliza para calentar la lente de inmersión en aceite
Medium 199 (M199), HEPES	TermoFisher Scientific	12340030	Cell Culture Medium Motion
Studio X64	IDT Motion	versión 2.14.01	Software
	Oil FischerScientific, Carl Zeiss
Cubreobjetos rectangulares	VWR	631-0145	Se utiliza para cubrir la cámara de visualización
Espaciador (Ispacer) 0,25 mm	Sunjinlab	IS203	Se utiliza para la creación de la cámara de visualización cerrada hermética
Cubreobjetos cuadrados	VWR	631-0122	Se utiliza para la creación de cámaras de visualización abiertas construidas en laboratorio
Estreptomicina/Penicilina	FisherScientific, Gibco	11548876	solución de antibióticos