Un método preciso y reproducible para la cuantificación in vivo de nucleósidos/nucleótidos en plantas se describe aquí. Este método emplea una HPLC-MS/MS.
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Artículo de método
Preparación de muestras de plantas para la medición del contenido de nucleósidos/nucleótidos con una HPLC-MS/MS
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Resumen
Resumen
Los nucleósidos/nucleótidos son bloques de construcción de ácidos nucleicos, partes de cosubstratos y coenzimas, moléculas de señalización celular y portadores de energía, que están involucrados en muchas actividades celulares. Aquí, describimos un método rápido y confiable para la calificación absoluta del contenido de nucleósidos / nucleótidos en plantas. Brevemente, se extrajeron 100 mg de material vegetal homogeneizado con 1 mL de tampón de extracción (metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de 2:2:1). Más tarde, la muestra se concentró cinco veces en un liofilizador y luego se inyectó en una HPLC-MS / MS. Los nucleótidos se separaron en una columna de carbono grafítico poroso (PGC) y los nucleósidos se separaron en una columna C18. Las transiciones de masa de cada nucleósido y nucleótido fueron monitoreadas por espectrometría de masas. El contenido de los nucleósidos y nucleótidos se cuantificó contra sus estándares externos (ESTDs). Usando este método, por lo tanto, los investigadores pueden cuantificar fácilmente nucleósidos/nucleótidos en diferentes plantas.
Introducción
Los nucleósidos/nucleótidos son componentes metabólicos centrales en todos los organismos vivos, que son los precursores de los ácidos nucleicos y muchas coenzimas, como el dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD), e importantes en la síntesis de macromoléculas como fosfolípidos, glicolípidos y polisacáridos. Estructuralmente, el nucleósido contiene una nucleobase, que puede ser una adenina, guanina, uracilo, citosina o timina, y una mitad de azúcar, que puede ser una ribosa o una desoxirribosa1,2. Los nucleótidos tienen hasta tres grupos fosfato que se une a la posición de 5 carbonos de la mitad azucarada d....
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Protocolo
1 Crecimiento de planta y colección de materiales
- Asegúrese de que las semillas de Arabidopsis se esterilizan en etanol al 70% durante 10 min y se siembran en las placas de agar, que se prepararon con nutrientes Murashige y Skoog de media fuerza.
- Incubar las placas que contienen semillas de Arabidopsis bajo la oscuridad a 4 °C durante 48 h, y luego transferirlas a una cámara de crecimiento controlado bajo 16 h de luz de 55 μmol m-2 s-1 a 22 °C y 8 h de oscuridad a 20 °C.
- Cosechar 100 mg de plántulas de 2 semanas (peso fresco) y congelar nitrógeno líquido para la extracción de metabolitos.
PRECAUC....
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Resultados
Aquí, mostramos la identificación y cuantificación de N1-metiladenosina, un nucleósido modificado conocido, en 2 semanas de edad Arabidopsis tipo salvaje (Col-0) plántulas como un ejemplo. El perfil de espectrometría de masas indicaque los iones producto generados a partir del estándar N 1-metiladenosina son 150 m/z y 133 m/z(Figura 2A),y el mismo perfil también se observa en la extracción de Col-0(Figura 2B.......
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Discusión
Los organismos contienen varios nucleósidos/nucleótidos, incluyendo los canónicos y aberrantes. Sin embargo, el origen y los puntos finales metabólicos de ellos, especialmente nucleósidos modificados, son todavía obscuros. Además, la comprensión actual de la función y la homeostasis del metabolismo de nucleósidos/nucleótidos sigue siendo explorada y ampliada. Para investigarlos, es necesario emplear un método preciso y de referencia para la identificación y cuantificación de estos metabolitos. Aquí, se describió un proto.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado financieramente por los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (KJQN202060), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31900907), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20190528), el Centro Internacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (CRP/CHN20-04_EC) a M.C., y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (LGZD202004) a X.L.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| acetonitrilo | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosina | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| acetato de amonio | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| citidina | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosina | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| columna Hypercarb | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosina | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| metanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-metiladenosina | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-metilguanosina | Carbosynth | NM02922 | |
| Medio Murashige y Skoog | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| columna Polaris 5 C18A | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridina | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridina | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
Referencias
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine b....
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Cuantificaci n de nucle sidos y nucle tidosan lisis por HPLC MS MStamp n de extracci n de metanol acetonitrilo y aguacolumna de carbono graf tico porososeparaci n en columna C18transiciones de espectrometr a de masascalibraci n con est ndar externoconcentraci n por liofilizadortrituraci n de tejido con nitr geno l quido
