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Artículo de método
Este protocolo proporciona métodos detallados y completos para el aislamiento, cultivo, polarización y medición del estado metabólico glucolítico de macrófagos vivos derivados de la médula ósea (BMDM). Este documento proporciona instrucciones paso a paso con ilustraciones visuales realistas para el flujo de trabajo y la evaluación glucolítica de BMDM en tiempo real.
Los macrófagos se encuentran entre las células presentadoras de antígenos más importantes. Se han identificado muchos subconjuntos de macrófagos con firmas metabólicas únicas. Los macrófagos se clasifican comúnmente como subtipos M1 (inflamatorios) y M2 (antiinflamatorios). Los macrófagos tipo M1 son macrófagos proinflamatorios que son activados por LPS y/o citocinas proinflamatorias como INF-γ, IL-12 e IL-2. Los macrófagos polarizados tipo M1 están involucrados en varias enfermedades al mediar la defensa del huésped contra una variedad de bacterias y virus. Esto es muy importante para estudiar los macrófagos M1 inducidos por LPS y sus estados metabólicos en enfermedades inflamatorias. Los macrófagos similares a M2 se consideran macrófagos antiinflamatorios, activados por citocinas y estimuladores antiinflamatorios. Bajo el estado proinflamatorio, los macrófagos muestran un aumento de la glucólisis en la función glucolítica. La función glucolítica se ha investigado activamente en el contexto de la glucólisis, la capacidad glucolítica, la reserva glucolítica, la glucólisis compensatoria o la acidificación no glucolítica utilizando analizadores de flujo extracelular (XF).
Este artículo demuestra cómo evaluar los estados glucolíticos en tiempo real con pasos fáciles de seguir cuando los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) están respirando, consumiendo y produciendo energía. Utilizando inhibidores y activadores específicos de la glucólisis en este protocolo, mostramos cómo obtener una visión sistémica y completa de los procesos metabólicos glucolíticos en las células y proporcionar resultados más precisos y realistas. Para poder medir múltiples fenotipos glucolíticos, proporcionamos un método de normalización fácil, sensible y basado en el ADN para la evaluación de la polarización de los BMDM. El cultivo, la activación/polarización y la identificación del fenotipo y el estado metabólico de los BMDM son técnicas cruciales que pueden ayudar a investigar muchos tipos diferentes de enfermedades.
En este trabajo, polarizamos los macrófagos M0 naïve a macrófagos similares a M1 y M2 con LPS e IL4, respectivamente, y medimos un conjunto completo de parámetros glucolíticos en BMDM en tiempo real y longitudinalmente a lo largo del tiempo, utilizando análisis de flujo extracelular y activadores e inhibidores glucolíticos.
Los macrófagos son una de las células más críticas del sistema inmunitario innato tipo M1. Están implicados en la eliminación de enfermedades infecciosas, fagocitosis, presentación de antígenos y regulación de la inflamación2. Además, se requiere que los macrófagos regulen otras células inmunitarias a través de varias citocinas que liberan3. Existe un amplio espectro en los fenotipos de macrófagos4. Dependiendo de las señales a las que están expuestos los macrófagos, se polarizan hacia diferentes estados inflamatorios ymetabólicos 5. Los ma....
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Los ratones fueron sacrificados humanamente de acuerdo con las pautas de la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) y la Asociación Americana para la Ciencia de los Animales de Laboratorio (AALAS) y utilizando protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas A&M (IACUC).
1. Recolección de médula ósea de ratones y cultivo de BMDM
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La glucólisis y la fosforilación oxidativa mitocondrial son las dos principales vías de producción de ATP en las células (Figura 4A). Algunas células tienen la capacidad de cambiar entre estas dos vías para satisfacer sus demandas de energía. La conversión de glucosa en piruvato en el citoplasma se denomina glucólisis. El piruvato tiene dos destinos; se convertirá en lactato o se metabolizará aún más a través del ciclo de TCA y, finalmente, a través de la cad.......
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Como se mencionó anteriormente, la máquina analizadora de flujo extracelular puede proporcionar información en tiempo real sobre dos de las principales vías de producción de energía de las células mediante la medición de OCR (tasa de consumo de oxígeno), un indicador de la actividad mitocondrial de OXFOS, y ECAR (tasa de acidificación extracelular), que es un indicador de glucólisis. Los macrófagos pueden utilizar ambas vías, dependiendo de su microentorno. También pueden cambiar sus vía.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecemos a la Sra. Joanna Rocha por su asistencia editorial. El trabajo fue parcialmente apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01DK118334 (a los Dres. Sun y Alaniz) y (NIH) R01A11064Z (a los Dres. Jayaraman y Alaniz).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agujas 23G | VWR | BD305145 | |
| 2-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Tubo cónico de 50 ml | VWR | 21008-951 | |
| ACK | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | Se puede fabricar en laboratorio Kit de |
| prueba de estrés de glucólisis Agilent Seahorse XF | Agilent Technologies 103020-100 | ||
| Guía del usuario del kit de prueba de estrés de glucólisis Agilent Seahorse XF | Agilent Technologies | 103020-400 | |
| Kit de ensayo de tasa glucolítica Agilent Seahorse XF Agilent | Technologies | 103344-100 | |
| Guía del usuario del kit de ensayo de tasa glucolítica Agilent Seahorse XF Agilent | Technologies | 103344-100 | |
| Alexa Fluor 488 anti-ratón CD206 (MMR) Anticuerpo | BioLegend | 141710 | |
| anti-ratón CD11b eFluor450 100ug | eBioscience | 48-0112-82 | |
| BD 3ML - JERINGA | VWR | Otras jeringas también son aceptables | |
| Contador de células-Vi-CELL- XR Sistema completo | BECKMAN COULTER Life Sciences | 731050 | Las células también se pueden contar manualmente |
| Cell Strainer-70µ m | VWR | 10199-656 | |
| Kit de ensayo de proliferación celular CyQUANT | Thermo Fisher Scientific | C7026 | |
| F4/80 anticuerpo monoclonal (BM8) pe-Cyanine7 | eBioscience | 25-4801-82 | |
| Suero fetal bovino | Life Technologies | 16000-044 | |
| Citómetro de flujo: BD LSFRFortessa X-20 | BD | 656385 | |
| Kim Toallitas | VWR | 82003-822 | |
| LPS-SM ultrapuro (tlrl-smpls) 5 mg | Invivogen | tlrl-smlps | |
| MCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| PE Rata Anti-Ratón CD38 | BD Biosciences | 553764 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| Placa de Petri 100mm x 15 mm | Fisher Scientific | F80875712 | |
| RPMI, Glutamax, HEPES | Invitrogen | 72400-120 | |
| Solución de calibración de caballito de mar | Agilent Technologies | 103059-000 | |
| Caballito de mar XF 200mM Solución de glutamina | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Kit de ensayo de tasa glucolítica Seahorse XF | Agilent Tecnologías | 103344-100 | |
| Caballito de mar XFe96 FluxPaks | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| XF Kit de prueba de esfuerzo de glucólisis | Agilent Technologies | 103020-100 | |
| XF RPMI Medio, pH 7.4 sin fenol Rojo | Agilent Technologies | 103336-100 |
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