Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.
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Artículo de método
Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos de ratón desempeñan un papel crucial en la investigación de la arritmia y permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis, incluida la función alterada del canal iónico y el manejo del calcio. Para este propósito, los cardiomiocitos auriculares o ventriculares de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de patch-clamp o para explorar anomalías en el manejo del calcio. Sin embargo, el rendimiento limitado de cardiomiocitos de alta calidad obtenidos por los protocolos de aislamiento actuales no permite ambas mediciones en el mismo ratón. Este artículo describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares murinos de alta calidad mediante perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, para mediciones simultáneas posteriores de transitorios de calcio y corriente de calcio tipo L de un animal. Se obtienen corazones de ratón y la aorta se canula rápidamente para eliminar la sangre. Los corazones se perfunden inicialmente con una solución libre de calcio (37 °C) para disociar el tejido a nivel de discos intercalados y luego con una solución enzimática que contiene poco calcio para alterar la matriz extracelular (37 °C). El corazón digerido se disecciona posteriormente en aurículas y ventrículos. Las muestras de tejido se cortan en trozos pequeños y se disuelven pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo. La digestión enzimática se detiene, y las células se reintroducen gradualmente a las concentraciones fisiológicas de calcio. Después de cargar con un indicador fluorescente de Ca2+, los cardiomiocitos aislados se preparan para la medición simultánea de corrientes y transitorios de calcio. Además, se discuten las trampas de aislamiento y se proporcionan protocolos de patch-clamp y trazas representativas de corrientes de calcio tipo L con mediciones transitorias simultáneas de calcio en miocitos murinos auriculares y ventriculares aislados como se describió anteriormente.
Introducción
Las arritmias cardíacas son comunes y uno de los principales desafíos actuales de atención médica, ya que afectan a millones de personas en todo el mundo. Las arritmias se asocian con alta morbilidad y mortalidad 1,2 y representan la causa subyacente de la mayoría de las muertes súbitas cardíacas3. Las opciones de tratamiento actualizadas han mejorado la supervivencia del paciente, pero siguen siendo principalmente tratamientos sintomáticos en lugar de dirigirse a los mecanismos subyacentes. Por lo tanto, estos tratamientos tienen una eficacia limitada y con frecuencia pueden causar
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por la Junta de Revisión de Animales de Baja Sajonia (LAVES, AZ-18/2900) y se llevaron a cabo de acuerdo con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar animal.
1. Preacuerdos
- Preparar 1 L de tampón de perfusión 10x (Tabla 1), 500 ml de 1x tampón de perfusión (Tabla 2), 50 ml de tampón de digestión (Tabla 3), 10 ml de tampón de parada (Tabla 4), 1 L de solución de Tyrode (Tabla 5), 10 ml de cada solución escalonada de calcio (solución de Tyrode con glucosa y la cantida....
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Resultados
El rendimiento de aislamiento se determina después de la reintroducción de calcio mediante el pipeteo de 10 μL de suspensión celular en un portaobjetos de microscopio. Más de 100 células viables, en forma de bastón, no contraídas/10 μL para el aislamiento de células auriculares y más de 1.000 células viables, en forma de bastón, no contraídas/10 μL para el aislamiento de células ventriculares se consideran rendimiento suficiente y se obtienen comúnmente utilizando este protocolo. Las células auriculares obtenidas con est.......
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Discusión
Este artículo proporciona una manera fácil y funcional de obtener miocitos auriculares y ventriculares de alta calidad del mismo ratón para estudios de parche y pinza con registros transitorios de calcio simultáneos. La calidad de los datos obtenidos depende en gran medida de la calidad del aislamiento celular. Como se mencionó anteriormente, muchos métodos para aislar cardiomiocitos murinos han sido descritos previamente 9,10,11,12.<.......
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 a P. Tomsits y D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 y SFB1002 proyecto A13 a N. Voigt), Fundación Alemana de Investigación bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania (EXC 2067/1- 390729940 a N. Voigt), Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss y N. Voigt; 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), la ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss), la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss) y la Fundación Else-Kröner-Frese....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Monoxima de 2,3-butanediona | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Cánula de 27G | Servoprax | L10220 | |
| 4-aminopiridina | Sigma-Aldrich | A78403 | |
| DMSO anhidro | Sigma-Aldrich | D12345 | |
| cánula aórtica | Radnoti | 130163-20 | |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| pinza quirúrgica roma | Kent Scientific | INS650915-4 | |
| Suero para terneros bovinos | Sigma-Aldrich | 12133C | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Baño de agua caliente circulante | Julabo | ME | |
| Colagenasa Tipo II | Worthington | LS994177 | |
| tijeras de disertación | Kent Scientific | INS600124 | |
| DL-aspartato K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Guanosina 5′-trifosfato tris | sal Sigma-Aldrich | G9002 | |
| Serpentín de calentamiento | Radnoti | 158821 | |
| Heparina | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
| cámara de inducción | CWE incorporada | 13-40020 | |
| Isoflurano | Cp-pharma | 1214 | |
| Cámara cardíaca encamisada | Radnoti | 130160 | |
| KCl | Merck | 1049360250 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Malla de nylon (200 µ m) | VWR-Alemania | 510-9527 | |
| pipeta pasteur | Sigma Aldrich | Z331759 | |
| placas de Petri | Thermo Fisher | 150318 | |
| Ácido plurónico F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bomba de rodillo | Ismatec | ISM597D | |
| quirúrgico pinza | Kent Scientific | INS650908-4 | |
| tijera quirúrgica | Kent Scientific | INS700540 | |
| seda de sutura | Fine Science Tools | ||
| Merck | Z683531-100EA | ||
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |
Referencias
- Camm, A. J., et al. Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).
- Chugh, S. S., et al.
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Reimpresiones y permisos
