En el presente estudio, se derriba la expresión de dos componentes de señalización aguas abajo de la vía PERK, la calcineurina citoprotectora y el CHOP proapoptótico, mediante el uso de shRNAs específicos. De manera opuesta, estos modulan la susceptibilidad de las neuronas corticales primarias a la atrofia de neuritas después de la inducción del estrés del retículo endoplásmico.
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Artículo de método
Modulación molecular por shRNAs específicos entregados por lentivirus en neuronas estresadas por retículo endoplásmico
En este artículo
Resumen
Resumen
La acumulación de proteínas desplegadas dentro del retículo endoplásmico (RE), causada por cualquier condición de estrés, desencadena la respuesta de proteína desplegada (UPR) a través de la activación de sensores especializados. UPR intenta primero restaurar la homeostasis; Pero si el daño persiste, la señalización induce apoptosis.
Cada vez hay más pruebas de que el estrés sostenido y no resuelto en el RE contribuye a muchas afecciones patológicas, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. Debido a que la UPR controla el destino celular cambiando entre procesos citoprotectores y apoptóticos, es esencial comprender los eventos que definen esta transición, así como los elementos involucrados en su modulación.
Recientemente, demostramos que la acumulación anormal de gangliósidos GM2 causa el agotamiento del contenido de ER Ca2+ , que a su vez activa PERK (PKR-like-ER kinase), uno de los sensores UPR. Además, la señalización de PERK participa en la atrofia de neuritas y la apoptosis inducida por la acumulación de GM2. En este sentido, hemos establecido un sistema experimental que nos permite modular molecularmente la expresión de los componentes PERK aguas abajo y así cambiar la vulnerabilidad de las neuronas a sufrir atrofia neurítica.
Realizamos knockdown de la expresión de calcineurina (citoprotector) y CHOP (pro-apoptótico) en cultivos neuronales corticales de rata. Las células se infectaron con shRNA específico entregado por lentivirus y luego se trataron con GM2 en diferentes momentos, fijados e inmunoteñidos con anticuerpos anti-MAP2 (proteína 2 asociada a microtubos). Más tarde, las imágenes celulares se registraron utilizando un microscopio de fluorescencia y el crecimiento total de neuritas se evaluó mediante el uso del software de procesamiento de imágenes de dominio público ImageJ. La inhibición de la expresión de esos componentes de señalización de PERK claramente hizo posible acelerar o retrasar la atrofia neurítica inducida por el estrés del RE.
Este enfoque podría usarse en modelos del sistema celular de estrés del RE para evaluar la vulnerabilidad de las neuronas a la atrofia de las neuritas.
Introducción
El estrés del retículo endoplásmico (RE) se define como cualquier perturbación que comprometa la capacidad de plegamiento de proteínas en el orgánulo. La acumulación de proteínas desplegadas dentro del lumen ER activa una señal de cascada de transducción llamada respuesta de proteína desplegada (UPR). Esta compleja vía de señalización está orquestada por tres sensores de estrés: PERK (proteína quinasa ER similar al ARN de la quinasa [PKR]), IRE1 (enzima 1 que requiere inositol) y ATF6 (factor de transcripción activado 6). Todos juntos intentan restaurar la homeostasis. Pero si el estrés persiste, la UPR finalmente induce la muerte celular por apoptosis
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Protocolo
Los procedimientos con animales se realizan siguiendo los protocolos aprobados de la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La aprobación para realizar el estudio es otorgada por el Comité de Cuidado y Ética Animal (CICUAL) del INIMEC-CONICET-UNC (Resolución números 014/2017 B y 006/2017 A).
1. Cultivos primarios de neuronas corticales de rata
- Anestesiar ratas preñadas E18 Wistar en una cámara de CO2 con una mezcla de 80% de CO2/20%O2 durante 60 s de exposición y luego sacrificar luego dislocando las vértebras cervicales.
- Realice los siguien....
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Resultados
Aquí, abordamos la cuestión de si el silenciamiento de dos componentes PERK aguas abajo afecta la fase de transición de UPR en un modelo de célula de estrés ER. Para lograr esto, silenciamos el gen CN-Aα así como el gen CHOP mediante dos secuencias específicas de shRNA para cada uno (Tabla 1) en cultivo de células neuronales primarias durante 1 día10. La expresión se analiza mediante Western blot (Figura 1 y Figur.......
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Discusión
Describimos un sistema experimental que permite la modulación molecular de la transición de la supervivencia a las fases APOPTÓTICAS de la UPR en un modelo de célula neuronal.
Para un análisis adecuado de la atrofia de neuritas, es esencial obtener cultivos de neuronas primarias con procesos numerosos, largos y altamente ramificados 9,11. Esto facilita el examen de la extensión del proceso neuronal, permitiendo detectar las claras dife.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Gonzalo Quasollo por su inestimable ayuda con la imagen y al Dr. Andrea Pellegrini por el apoyo técnico del cultivo celular.
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de: el Instituto Nacional de Salud, EE.UU. (#RO1AG058778-01A1, Acuerdo de Subadjudicación No 165148/165147 entre UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) y de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actina | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinina | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Microscopio de epifluorescencia Axiovert 200 | Zeiss | ||
| B27 suplemento | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Suero para becerros fetales (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Pinzas de punta fina estilo #5 | Dumont | ||
| estilo #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW anticuerpo secundario | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 anticuerpo secundario | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW anticuerpo secundario | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW anticuerpo secundario | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| plásmido de envoltura lentiviral pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| plásmido de empaquetamiento lentiviral psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| vector lentiviral pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Hemisulfato de leupeptina | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reactivo (reactivo de transfección de plásmidos) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium Life | Technologies | #21103049 | |
| Membrana de nitrocelulosa 0.45 & micro; m | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey sistema de imagen infrarroja | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Medios de suero reducidos) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicilina-estreptomicina | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatina A | Santa Cruz Biotecnología | #45036 | |
| fenilmetilsulfonilo fluoruro Santa | Cruz Biotecnología | #329-98-6 | |
| Poly-L-lisina | sigma aldrich | P#2636 | |
| Tijeras de resorte pequeñas rectas y afiladas | Herramientas | ||
| T4 ADN Ligasa | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps Sistema de purificación de ADN | Promega | #A1330 |
Referencias
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its act....
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Reimpresiones y permisos
