Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

Zachary J. Kirsch; Blaise G. Arden; Richard W. Vachet; Patanachai Limpikirati

doi:10.3791/61983

Artículo de método

Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

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DOI:

10.3791/61983

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15 de junio de 2021

Zachary J. Kirsch¹ , Blaise G. Arden¹ , Richard W. Vachet^*¹^,² , Patanachai Limpikirati^*³

¹Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, ²Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, ³Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se describen los procedimientos experimentales para realizar el etiquetado covalente a base de dietilpirocarbonato con detección espectrométrica de masas. El dietilpirocarbonato simplemente se mezcla con la proteína o complejo proteico de interés, lo que lleva a la modificación de residuos de aminoácidos accesibles al disolvente. Los residuos modificados se pueden identificar después de la digestión proteolítica y la cromatografía líquida / análisis de espectrometría de masas.

Resumen

Caracterizar la estructura de orden superior de una proteína es esencial para comprender su función. La espectrometría de masas (EM) ha surgido como una poderosa herramienta para este propósito, especialmente para los sistemas de proteínas que son difíciles de estudiar por métodos tradicionales. Para estudiar la estructura de una proteína por EM, se realizan reacciones químicas específicas en solución que codifican la información estructural de una proteína en su masa. Un enfoque particularmente efectivo es utilizar reactivos que modifican covalentemente las cadenas laterales de aminoácidos accesibles con disolventes. Estas reacciones conducen a aumentos de masa que se pueden localizar con la resolución del nivel de residuos cuando se combinan con la digestión proteolítica y la espectrometría de masas en tándem. Aquí, se describen los protocolos asociados con el uso de dietilpirocarbonato (DEPC) como un reactivo de etiquetado covalente junto con la detección de MS. DEPC es una molécula altamente electrofílica capaz de etiquetar hasta el 30% de los residuos en la proteína media, proporcionando así una excelente resolución estructural. DEPC se ha utilizado con éxito junto con la EM para obtener información estructural de pequeñas proteínas de un solo dominio, como la β2-microglobulina, a grandes proteínas multidominio, como los anticuerpos monoclonales.

Introducción

Las proteínas son biomoléculas esenciales en prácticamente todos los procesos fisiológicos. La variedad de funciones que realizan las proteínas son posibles debido a las estructuras que adoptan y las interacciones que tienen con otras biomoléculas. Para entender la función de la proteína en un nivel más profundo, se necesitan herramientas bioquímicas y biofísicas para dilucidar estas importantes características e interacciones estructurales. Tradicionalmente, la cristalografía de rayos X, la microscopía electrónica criogénica y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) han proporcionado el detalle a nivel atómico deseado para revelar la estructura de la ....