Describimos la producción de cultivos mixtos de astrocitos y células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales fetales o adultas que se diferencian en oligodendrocitos maduros, y el modelado in vitro de estímulos nocivos. El acoplamiento con una técnica de detección de alto contenido basada en células construye un sistema de detección de drogas confiable y robusto.
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Artículo de método
Diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas
En este artículo
Resumen
Resumen
El principal obstáculo en el desarrollo de técnicas de cribado farmacológico para evaluar la eficacia de las estrategias terapéuticas en enfermedades complejas es lograr un equilibrio entre la simplificación in vitro y la recreación del complejo entorno in vivo, junto con el objetivo principal, compartido por todas las estrategias de cribado, de obtener datos robustos y fiables, altamente predictivos para la traducción in vivo.
En el campo de las enfermedades desmielinizantes, la mayoría de las estrategias de detección de fármacos se basan en líneas celulares inmortalizadas o cultivos puros de células precursoras de oligodendrocitos primarios (OPC) aisladas de animales recién nacidos, lo que lleva a fuertes sesgos debido a la falta de diferencias relacionadas con la edad y de cualquier condición o complejidad patológica real.
Aquí mostramos la configuración de un sistema in vitro destinado a modelar la diferenciación fisiológica / maduración de las OPC derivadas de células madre neurales (NSC), fácilmente manipulables para imitar las condiciones patológicas típicas de las enfermedades desmielinizantes. Además, el método incluye el aislamiento de cerebros fetales y adultos, dando un sistema que se diferencia dinámicamente de los OPC a los oligodendrocitos maduros (OL) en un cocultivo espontáneo que también incluye astrocitos. Este modelo se asemeja fisiológicamente al proceso de mielinización y reparación de mielina mediado por hormona tiroidea, lo que permite la adición de interferentes patológicos que modelan los mecanismos de la enfermedad. Mostramos cómo imitar los dos componentes principales de las enfermedades desmielinizantes (es decir, hipoxia / isquemia e inflamación), recreando su efecto sobre la mielinización del desarrollo y la reparación de la mielina adulta y teniendo en cuenta todos los componentes celulares del sistema en todo momento, mientras nos centramos en diferenciar los OPC.
Este modelo mixto espontáneo, junto con las tecnologías de cribado de alto contenido basadas en células, permite el desarrollo de un sistema de cribado farmacológico robusto y fiable para estrategias terapéuticas dirigidas a combatir los procesos patológicos implicados en la desmielinización y a inducir la remielinización.
Introducción
En el sistema nervioso central (SNC), las células formadoras de mielina (oligodendrocitos, OL) y sus precursores (células precursoras de oligodendrocitos, OPC) son responsables de la mielinización del desarrollo, un proceso que ocurre durante los períodos peri y postnatal, y del recambio y reparación de la mielina (remielinización) en la edad adulta1. Estas células están altamente especializadas, interactuando anatómica y funcionalmente con todos los demás componentes gliales y neuronales, lo que las convierte en una parte fundamental de la estructura y función del SNC.
Los eventos desmielinizantes están implicados e....
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Protocolo
Todos los protocolos con animales descritos en este documento se llevaron a cabo de acuerdo con las Directivas del Consejo de la Comunidad Europea (86/609/CEE) y cumplen con las directrices publicadas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Soluciones y reactivos
- Preparar el medio estándar: DMEM / F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg de penicilina/estreptomicina (1% P/S); 1x B27; 1x N-2.
- Preparar el medio de la neuroesfera: agregue 10 ng / ml de bFGF; 10 ng/mL EGF a medio estándar.
- Preparar el medio de la oligosfera/OPC: añadir 10 ng/mL bFGF; 10 ng/mL PDGF-AA....
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Resultados
La primera fase del cultivo puede variar en duración, dependiendo de la densidad de siembra y de si las esferas son de origen fetal o adulto. Además, las oligoesferas muestran una población reducida que se duplica en comparación con las neuroesferas(Figura 1B). Además, la producción de esferas a partir de tejido adulto es más lenta y puede tomar de 2 a 3 semanas generar oligoesferas en comparación con las fetales que pueden tardar de 1 a 2 semanas, dependiendo de la densidad de siembra.
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Discusión
La naturaleza compleja de los procesos de mielinización/remielinización y los eventos desmielinizantes hace que el desarrollo de sistemas predictivos in vitro sea extremadamente desafiante. Los sistemas de cribado de fármacos in vitro más utilizados son en su mayoría líneas celulares humanas o cultivos PRIMARIOS PUROS DE OL, con un uso cada vez mayor de cocultivos u sistemas organotípicos más complejos15. Incluso si tales sistemas se combinan con tecnologías de alto contenido, los cultivos OL puro.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Con el apoyo del proyecto MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744), y Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Un agradecimiento especial a la Fundación IRET por acoger el trabajo experimental.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de 96 pocillos - sin tratar | Suplemento de NUNC | 267313 | |
| B27 (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Factor neurotrópico ciliar (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM sin glucosa | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Factor de crecimiento epidérmico (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| hialuronidasa | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1 y beta; | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminina | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetil-L-cisteína | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 suplemento (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Tampón de disociación no enzimática | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicilina / Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poli-D,L-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β 1 | Orígenes | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triyodotironina | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T1426 |
Referencias
- Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340(2015).
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional ....
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Reimpresiones y permisos
