Este artículo describe los procedimientos experimentales para (a) el agotamiento de U1 snRNP de extractos nucleares, con pérdida concomitante de la actividad de empalme; y (b) reconstitución de la actividad de empalme en el extracto agotado de U1 por partículas de galectina-3 - U1 snRNP unidas a perlas covalentemente acopladas con anticuerpos anti-galectina-3.
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Artículo de método
Complementación de la actividad de empalme por un complejo de galectina-3 - U1 snRNP en perlas
En este artículo
Resumen
Resumen
Los experimentos clásicos de agotamiento-reconstitución indican que la galectina-3 es un factor de empalme requerido en los extractos nucleares. El mecanismo de incorporación de galectina-3 en la vía de empalme se aborda en este trabajo. La sedimentación de extractos nucleares de células HeLa en gradientes de glicerol del 12% al 32% produce fracciones enriquecidas en una partícula endógena ~ 10S que contiene galectina-3 y U1 snRNP. Ahora describimos un protocolo para agotar los extractos nucleares de U1 snRNP con pérdida concomitante de la actividad de empalme. La actividad de empalme en el extracto agotado de U1 puede ser reconstituida por la partícula snRNP de galectina-3 - U1 atrapada en las perlas de agarosa acoplada covalentemente con anticuerpos anti-galectina-3. Los resultados indican que el complejo ternario galectina-3 - U1 snRNP - pre-ARNm es un complejo E funcional que conduce a intermediarios y productos de la reacción de empalme y que la galectina-3 entra en la vía de empalme a través de su asociación con U1 snRNP. El esquema de uso de complejos de afinidad o inmunoseleccionados en perlas para reconstituir la actividad de empalme en extractos agotados de un factor de empalme específico puede ser generalmente aplicable a otros sistemas.
Introducción
La producción de la mayoría de los ARN mensajeros eucariotas (ARNm) implica la eliminación de intrones y la ligadura de exones en un proceso nuclear denominado empalme pre-ARNm1. Dos clases de complejos ARN-proteína (RNPs) dirigen el procesamiento del ARN pre-mensajero en ARNm maduro a través de complejos espliceosómicos. Una clase, los RNPs pre-mensajeros nacientes, se forma co-transcripcionalmente por la unión de proteínas RNP nucleares heterogéneas y otras proteínas de unión a ARN, incluyendo algunos miembros de la familia SR, produciendo complejos hnRNP2. Los RNPs nucleares pequeños ricos en uracilo de segunda clase ....
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Protocolo
1. Notas sobre los procedimientos generales
- Asegúrese de que todos los productos químicos (componentes tampón, enzimas, etc.) se mantengan libres de ribonucleasa (RNasa). Secuestrar todas las botellas de reactivos compradas comercialmente del uso general en el laboratorio. Use guantes para todos los pasos del procedimiento experimental. Utilice solo cristalería y utensilios que hayan sido horneados (consulte el paso 1.2 a continuación) y soluciones que hayan sido tratadas previamente (consulte el paso 1.3 a continuación).
- Hornea toda la cristalería (vasos de precipitados, frascos, botellas, pipetas, etc.) durante un mínimo de 4 h a 177 °C. Envuelv....
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Resultados
Los complejos NE agotados de U1 snRNP (U1ΔNE de la Sección 2.2.6) y Gal3 - U1 snRNP de la región 10S del gradiente de glicerol inmunoprecipitado por anti-Gal3 (paso 3.2.7) se mezclaron en una reacción de empalme. Esta mezcla de reacción contenía SnRNA U1 (Figura 2A, carril 3), así como la proteína específica U1, U1-70K (Figura 2B, carril 3). Como era de esperar, el anti-Gal3 precipitó Gal3 (Figura 2B.......
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Discusión
Este informe proporciona los detalles experimentales que documentan que un complejo snRNP Gal3 - U1 atrapado en perlas recubiertas anti-Gal3 puede unirse al sustrato pre-ARNm y este complejo ternario puede restaurar la actividad de empalme a un NE agotado de U1 snRNP. Gal3 es un miembro de una familia de proteínas originalmente aisladas sobre la base de su actividad de unión a carbohidratos específicos de galactosa23 . Los estudios tempranos de inmunofluorescencia y fraccionamiento subcelular prop.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por national Science Foundation Grant MCB-0092919 y Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (a RJP) y por National Institutes of Health Grant GM-38740 y Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (a JLW).
El sustrato minx de pre-ARNm utilizado en los ensayos de empalme fue un amable regalo de la Dra. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, EE. UU.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| anti-U1 snRNP | El sitio de unión | Hu ENA-RNP #33471 | suero autoinmune humano específico para U1 snRNP |
| filtro de vacío en la parte superior | Fisher Scientific | Corning 431153 (0.22 μ m; PES 150 ml) | para soluciones filtrantes que contienen |
| centrífuga | International Equipment Company | IEC Modelo PR-6 | para peletización Perlas de sefarosa en inmunoprecipitación |
| dietilpirocarbonato (DEPC) | Sigma-Aldrich | 159220-5G | para el tratamiento del agua utilizada en la preparación de todas las soluciones |
| dimetilpimelimidato (DMP) | Sigma-Aldrich | 80490-5G | para anticuerpo de reticulación contra perlas de sefarosa |
| célula de electroforesis | BioRad Laboratories, Inc | Mini-Protean II | para la separación SDS-PAGE de proteínas |
| etanolamina | Sigma-Aldrich | 411000-100ml | para el bloqueo después de la reacción de reticulación |
| sistema de electroforesis en gel | Hoefer, Inc | HSI SE 500 Series | para la separación de snRNAs por electroforesis en gel losa |
| gel secador | BioRad | Modelo 224 | para el secado de losas de gel para autorradiografía |
| Membrana Hybond ECL | GE Healthcare | RPN3032D (0,2 μ m; 30 cm x 3 m) | para inmunotransferencia de proteínas en microdializador de membrana |
| (12 x 100 μ l capacidad de la muestra) | Sistema | microdializador Pierce 100 | para intercambiar el tampón del extracto nuclear |
| membranas de microdializador (corte de 8K) | Pierce | 66310 | para intercambiar el tampón de extracto nuclear |
| leche en polvo descremada | Spartan Stores | Spartan Instant Leche en polvo | |
| Protein A Sepharose CL-4B | Millipore-Sigma | GE 17-0780-01 | para el acoplamiento de anticuerpos a perlas |
| Proteinasa K | Millipore-Sigma | P2308-5mg | para detener la reacción de empalme para aislar los ARN |
| RNasin | Promega | N2111 | para inhibir la actividad |
| de la ribonucleasabalancín/rotador | Lab Industries, Inc | Labquake Shaker 400-110 | para mezclar soluciones de proteínas en reacciones de acoplamiento y en inmunoprecipitación |
| Safety-Solve | Research Products International Corp. | Nº 111177 | cóctel de conteo de centelleo para la determinación de la radiactividad en |
| contador de centelleo | Beckman Instruments LS6000SC | contador de centelleo para la determinación de la radiactividad | |
| concentrador de vacío de velocidad | Savant | SVC 100H | para el secado de gránulos de ARN precipitados con etanol |
| Unidad de electroforesis Transphor | Hoefer, Inc | Hoefer TE Series Transphor | para la transferencia de proteínas de SDS-PAGE a la membrana de transferencia |
Referencias
- Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
- Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Sc....
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Reimpresiones y permisos
