Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.
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Artículo de método
Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares
En este artículo
Resumen
Resumen
Las investigaciones sobre la fisiopatología y las dianas terapéuticas en distrofias musculares se han visto obstaculizadas por la limitada capacidad proliferativa de los mioblastos humanos. Se han creado varios modelos de ratón, pero no representan realmente la fisiopatología humana de la enfermedad o no son representativos del amplio espectro de mutaciones que se encuentran en los seres humanos. La inmortalización de los mioblastos primarios humanos es una alternativa a esta limitación; sin embargo, todavía depende de biopsias musculares, que son invasivas y no fácilmente disponibles. Por el contrario, las biopsias cutáneas son más fáciles de obtener y menos invasivas para los pacientes. Los fibroblastos derivados de biopsias de piel pueden ser inmortalizados y transdiferenciados en mioblastos, proporcionando una fuente de células con un excelente potencial miogénico. Aquí, describimos un método de reprogramación rápida y directa de fibroblasto en un linaje miogénico. Los fibroblastos se transducen con dos lentivirus: hTERT para inmortalizar el cultivo primario y un MYODinducible en tet, que tras la adición de doxiciclina, induce la conversión de fibroblastos en mioblastos y luego miotubes maduros, que expresan marcadores de diferenciación tardía. Este protocolo de transdiferenciación rápida representa una poderosa herramienta para investigar mecanismos patológicos e investigar bioterapias innovadoras basadas en genes o farmacológicas para trastornos neuromusculares.
Introducción
Los modelos celulares obtenidos directamente de los tejidos humanos son útiles para modelar muchos trastornos genéticos humanos, con la ventaja de tener el contexto genómico original y, en muchos casos, reproducir las mismas señas de identidad moleculares y celulares observadas en los pacientes. En el campo de los trastornos neuromusculares, biopsias musculares han sido una gran fuente de mioblastos humanos y han ayudado en la elucidación de mecanismos patológicos. Además, son una herramienta importante para las pruebas in vivo de fármacos y terapias génicas. Por un lado, la derivación de mioblastos de fragmentos musculares es relativamente fácil. Por otro la....
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Protocolo
Todos los experimentos y biopsias se llevaron a cabo siguiendo las reglas éticas de las instituciones involucradas bajo la aprobación de la Junta Nacional de Revisión Institucional del Hospital de Niños.
1. Inicio del cultivo de fibroblastos dérmicos
- Establecimiento del cultivo de fibroblastos
- Aliquot 10 mL de medio fibroblasto(Tabla 1)en tubos cónicos de 15 ml. La biopsia de la piel debe colocarse y transportarse en este medio. La biopsia se puede almacenar a 4 °C hasta que se procese, preferentemente el mismo día.
NOTA: Utilice la biopsia de piel en un plazo de 24-36 horas para evitar el crecimiento p....
- Aliquot 10 mL de medio fibroblasto(Tabla 1)en tubos cónicos de 15 ml. La biopsia de la piel debe colocarse y transportarse en este medio. La biopsia se puede almacenar a 4 °C hasta que se procese, preferentemente el mismo día.
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Resultados
Este protocolo muestra cómo establecer cultivos de fibroblastos derivados de la piel humana y convertirlos en mioblastos y luego en miotubes diferenciados. Este tipo de línea celular es extremadamente útil para el estudio de trastornos neuromusculares y pruebas in vitro de terapias potenciales.
Se muestra una representación esquemática de la conversión fibroblasta en la figura 1. La Figura 2A muestra un fragmento de piel y lo.......
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Discusión
Para obtener líneas celulares FM con buena calidad, algunos pasos son críticos. Cuanto antes se procese la biopsia de la piel, mayores serán las posibilidades de obtener fibroblastos sanos. El número de pasajes de cultivos de fibroblastos también es importante. Las células primarias tienen una capacidad proliferativa limitada y después de muchos pasajes, entran en senescencia replicativa. Por lo tanto, es mejor tener un stock de fibroblastos en un número de paso bajo y transformar las células en el paso más temprano posi.......
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Divulgaciones
El Hospital Nacional de Niños ha autorizado el programa de saltos exon 2 descrito aquí a Audentes Therapeutics. K.M.F. y N.W. han recibido pagos de regalías como resultado de esta licencia.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias al Dr. Vincent Mouly por compartir sus conocimientos en el pasado con respecto al modelo. Este trabajo ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Salud del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Estados Unidos (R01 NS043264 (K.M.F., y R.B.W.)), el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticos y cutáneas (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., y N.W.). N.W. ha recibido apoyo de becas de la Universidad Estatal de Ohio/Nationwide Children's Hospital Muscle Group y la Fundación Philippe. Este trabajo también fue apoyado por fondos discrecionales internos y parte de la obra de sal....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plato de 100 mm | Corning | 430167 | |
| 0,25% Tripsina-EDTA, rojo fenol | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Placa de 12 pocillos | Corning | 3513 | |
| 20X Tampón de transferencia | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetato SDS tampón de funcionamiento | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Gel de acetato de tris | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| matraz de 75 cm2 | Corning | 430641U | |
| Antibiótico-Antimicótico 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Cadena pesada anti-miosina, anticuerpo de sarcómero | Estudios de desarrollo Banco de hibridadores | MF20 sobrenadante | Dilución 1:50 |
| Antioxidante | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Ensayo de proteínas | Thermo Fisher | 23227 | |
| Cloroformo | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilución 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, Alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvato | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Clorhidrato de doxiciclina | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 imprimadores humanos | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5 | ' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'Anticuerpo contra la | |
| distrofina | Abcam | ab15277 | Dilución 1:200 |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Cabra anti-ratón, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilución 1:1000 |
| Halt Cóctel inhibidor de la proteasa 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocitómetro | Hausser Scientific | 3100 | |
| Higromicina B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD anti-Conejo de cabra IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilución 1:5000 |
| Lab-Tek II Sistema de correderas de cámara CC2 | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamina 3000 Reactivo de transfección | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel Matriz de membrana GFR | Corning | 354230 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Contenedor de congelación | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Membrana de nitrocelulosa 0,45 µ m | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Control normal del suero de cabra | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Tampón de bloqueo para Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Mezcla maestra de PCR | Thermo Fisher | K0172 | |
| Inhibidor de la fosfatasa | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Tinción de proteína total para la normalización de Western Blot | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrador-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Bisturíes | Aspen Quirúrgico | 372611 | |
| Medio de diferenciación de células musculares esqueléticas | Promocell | C23061 | |
| Medio de crecimiento de células musculares esqueléticas | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | ||
| reactivo | TRIzolThermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Congelador de temperatura ultrabaja | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield medio de montaje antidecoloración | Vector Labs | H1000 |
Referencias
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological....
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Reimpresiones y permisos
