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Artículo de método

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

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DOI:

10.3791/61991

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3 de abril de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Resumen

Las investigaciones sobre la fisiopatología y las dianas terapéuticas en distrofias musculares se han visto obstaculizadas por la limitada capacidad proliferativa de los mioblastos humanos. Se han creado varios modelos de ratón, pero no representan realmente la fisiopatología humana de la enfermedad o no son representativos del amplio espectro de mutaciones que se encuentran en los seres humanos. La inmortalización de los mioblastos primarios humanos es una alternativa a esta limitación; sin embargo, todavía depende de biopsias musculares, que son invasivas y no fácilmente disponibles. Por el contrario, las biopsias cutáneas son más fáciles de obtener y menos invasivas para los pacientes. Los fibroblastos derivados de biopsias de piel pueden ser inmortalizados y transdiferenciados en mioblastos, proporcionando una fuente de células con un excelente potencial miogénico. Aquí, describimos un método de reprogramación rápida y directa de fibroblasto en un linaje miogénico. Los fibroblastos se transducen con dos lentivirus: hTERT para inmortalizar el cultivo primario y un MYODinducible en tet, que tras la adición de doxiciclina, induce la conversión de fibroblastos en mioblastos y luego miotubes maduros, que expresan marcadores de diferenciación tardía. Este protocolo de transdiferenciación rápida representa una poderosa herramienta para investigar mecanismos patológicos e investigar bioterapias innovadoras basadas en genes o farmacológicas para trastornos neuromusculares.

Introducción

Los modelos celulares obtenidos directamente de los tejidos humanos son útiles para modelar muchos trastornos genéticos humanos, con la ventaja de tener el contexto genómico original y, en muchos casos, reproducir las mismas señas de identidad moleculares y celulares observadas en los pacientes. En el campo de los trastornos neuromusculares, biopsias musculares han sido una gran fuente de mioblastos humanos y han ayudado en la elucidación de mecanismos patológicos. Además, son una herramienta importante para las pruebas in vivo de fármacos y terapias génicas. Por un lado, la derivación de mioblastos de fragmentos musculares es relativamente fácil. Por otro lado, la cultura y el mantenimiento de los mioblastos primarios son difíciles, debido a su limitada tasa de proliferación y senescencia replicativa in vitro1. Una alternativa para estas limitaciones es inmortalizar los mioblastos con la inserción de los genes telomerasa humana(hTERT)y/o quinasa 4(CDK4)dependientes de la ciclina2,3,con preservación de las características musculares esqueléticas4. Sin embargo, la obtensión de los mioblastos primarios sigue dependiendo de la biopsia muscular, un procedimiento quirúrgico con desventajas para los pacientes, que, en muchos casos, tienen sus músculos en degeneración avanzada. Así, el músculo de estos pacientes se compone de una proporción significativa de tejido fibromático y/o adiposo y produce menos células musculares, requiriendo la purificación de las células previamente a la inmortalización.

A diferencia de las biopsias musculares, las biopsias de la piel son más accesibles y son menos dañinas para los pacientes. Los fibroblastos primarios se pueden derivar de fragmentos de piel in vitro. Aunque los fibroblastos no se ven afectados principalmente por mutaciones que causan trastornos neuromusculares, pueden ser transdiferenciados en mioblastos. Esto se puede lograr mediante la inserción del gen Myod, un factor de transcripción regulador miogénico5. En este manuscrito, describimos el protocolo para obtener mioblastos transdiferenciados, desde el establecimiento de cultivos de fibroblastos hasta la obtensión de miotubes diferenciados (se representa un resumen representativo del método en la Figura 1).

Las pruebas preclínicos de estrategias terapéuticas dependen de modelos celulares y animales portadores de mutaciones similares a las mutaciones encontradas en pacientes humanos. Aunque el desarrollo de modelos animales se ha vuelto más factible con el avance de tecnologías de edición genética como CRISPR/Cas96,sigue siendo desafiante y costoso. Por lo tanto, las líneas celulares derivadas del paciente son una opción accesible para tener modelos, cubriendo el gran espectro de mutaciones de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). La obtención y la creación de modelos celulares son cruciales para el desarrollo de terapias personalizadas para este tipo de patologías.

Entre las terapias personalizadas que se han investigado, las estrategias de salto exon es una de las prometedoras para diferentes distrofias musculares7,8. Esta estrategia consiste en producir una proteína más corta pero funcional. Esto se realiza ocultando la definición exon al empalme, excluyendo así el exon mutado del mensajero final. Esta es una tecnología muy prometedora que ha sido aprobada por la FDA para dmd. Así, también describimos en este protocolo, métodos para transfectar mioblasts con dos exon diferentes saltando tecnologías relacionadas: oligonucleótidos antisense (AON) y virus asociados al U7snRNA-adeno (AAV). La transfección AON es una buena herramienta para la proyección inicial de varias secuencias diseñadas para promover el salto exon9. Sin embargo, la actividad de los AON es transitoria. Para obtener una expresión sostenida de secuencias antisense, también exploramos pequeñas ANR nucleares (SNRNAs) combinadas con AAV, permitiendo la localización e inclusión nuclear en la maquinaria de empalme10. U7 es un snRNA implicado en el procesamiento de ARNm de histona que se puede diseñar para unir proteínas que lo redirigirán al empalme y entregarán secuencias antisense11. El uso de SNRNAs U7 modificados en combinación con vectores AAV supera las limitaciones de los AONs, lo que resulta en una expresión continua de los ANV y una mejor transducción de tejidos de interés12. Utilizamos células derivadas de pacientes con DMD para este protocolo para ilustrar la estrategia de salto exon.

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Protocolo

Todos los experimentos y biopsias se llevaron a cabo siguiendo las reglas éticas de las instituciones involucradas bajo la aprobación de la Junta Nacional de Revisión Institucional del Hospital de Niños.

1. Inicio del cultivo de fibroblastos dérmicos

  1. Establecimiento del cultivo de fibroblastos
    1. Aliquot 10 mL de medio fibroblasto(Tabla 1)en tubos cónicos de 15 ml. La biopsia de la piel debe colocarse y transportarse en este medio. La biopsia se puede almacenar a 4 °C hasta que se procese, preferentemente el mismo día.
      NOTA: Utilice la biopsia de piel en un plazo de 24-36 horas para evitar el crecimiento potencial de la contaminación.
    2. Aspirar los medios del tubo y enjuagar la biopsia con 10 mL 1X PBS (temperatura ambiente) tres veces. Después del tercer lavado, deje el PBS en el tubo.
    3. Vierta el PBS y la piel en un plato de 10 cmy 2.
    4. Usando bisturíes estériles, corta la biopsia en fragmentos lo más pequeños posible.
    5. Con una pipeta, transfiera un fragmento de piel individual y colópelo en un plato limpio de 10 cmy 2. Coloque de 10 a 12 fragmentos por plato.
    6. Aspirar el exceso de PBS de alrededor de cada fragmento. Tenga cuidado de no aspirar el fragmento.
    7. Cubra los platos parcialmente con la tapa y deje que los fragmentos de la piel se sequen durante 5-20 min. No permita que los fragmentos se sequen excesivamente.
    8. Una vez que los fragmentos estén secos, incline el plato a 45 grados y agregue lentamente 12 ml de fibroblasto medio a la esquina. Baje el plato, distribuyendo cuidadosamente los medios de comunicación para que los fragmentos no los levanten los medios de comunicación.
    9. Coloque los platos en la incubadora (37 °C, 5% CO2). Reemplace los medios en 5-7 días, y una vez a la semana siguiente.
    10. Observe los fibroblastos que emergen del fragmento(Figura 2)y, una vez confluentes, pase las células a frascos de 75 cmy 2. Retire el medio, enjuague las células con PBS y agregue 1 mL 0.25 % trypsin. Incubar a 37 °C durante 5 minutos o hasta que se levanten todas las células. Añadir 10 mL fibroblasto medio de crecimiento para inhibir la trippsina y transferir las células a un nuevo matraz.
      NOTA: Para la nomenclatura del número de paso, P1 se establece cuando los primeros fibroblastos que surgieron de la biopsia de la piel se transfieren a un nuevo matraz para la proliferación.
  2. Criopreservación de las líneas primarias de fibroblastos
    1. Una vez que el matraz de 75 cm2 sea confluente, enjuáguelo con 10 mL 1X PBS y aspirar PBS.
    2. Añadir 3 ml de 0,25 % de trypsina a la superficie celular. Coloque el matraz en la incubadora durante 5 minutos. Compruebe los matraces debajo del microscopio para ver si las células están levantadas. Si no es así, coloque el matraz de nuevo en la incubadora durante 5 minutos adicionales.
    3. Una vez que las células están separadas, agregue 7 ml de medios fibroblastos al matraz y pipeta hacia arriba y hacia abajo para volver a usar las células. Recoge las células en un tubo cónico de 50 ml.
    4. Preparar 100 μL aliquot de azul tripán, y eliminar 100 μL de la muestra que se está criopreservando, mezclar con el azul trypan. Cargue la mezcla en el hemociclo para contar. Cuente las células en cuatro campos diferentes del hemociclograma bajo el microscopio. Para calcular el número total de celdas, utilice la fórmula: (celdas contadas/100) * volumen de cultivo.
    5. Gire los tubos cónicos a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente o a 4 °C.
    6. Aspirar fuera del medio y resuspend las células en el volumen adecuado de medio de congelación: 1 mL por cada 1 millón de células / vial. Pipeta arriba y abajo para homogeneizar y distribuir 1 mL a cada criovial etiquetado.
    7. Coloque los viales en la caja de congelación y deje que los viales se congele a una velocidad de 1 °C/min a -80 °C congelador durante la noche.
    8. Al día siguiente transfiera los viales a un tanque de nitrógeno líquido o al congelador -150 °C.

2. Establecimiento de la línea celular FibroMyoblasts (FM)

  1. Fibroblastos primarios de semillas en aproximadamente el 30% de la confluencia en dos pozos de una placa de 12 pozos (2 x 104 células/pozo) con el fin de tener alrededor del 50% de la confluencia al día siguiente.
  2. Para la transducción lentiviral, añadir de 2 a 5 x 109 vg (partículas del genoma viral) de hTERT-puromicina lentivirus en 400 μL de medio fibroblasto. Al segundo pozo, agregue sólo 400 μL de fibroblasto medio. Agregue 1 ml de medios al día siguiente.
    NOTA: Los plásmidos para la producción de lentivirus se obtuvieron del grupo que publicó el artículo Chaouch et al, 2009. También se describen individualmente en Aure et al, 200713 para plásmido hTERT y Barde et al, 200614 para el sistema Tet-on utilizado para el diseño de plásmido MyoD. Se obtuvieron gracias a un Acuerdo de Transferencia de Material con Genethon, Francia (póngase en contacto con el Dr. Vincent Mouly para obtener estos plásmidos - vincent.mouly@upmc.fr). Brevemente, el hTERT consiste en hTERT variante 1 conducido por un promotor CMV mientras que la puromicina es impulsada por un promotor PGK. El plásmido MyoD contiene una variante myoD 1 impulsada por un promotor cmv bajo el control del represor rtTA2. Este plásmido también contiene la selección de higromicina expresada gracias al promotor SV40.
    Los Lentivirus se produjeron utilizando la producción lentiviral regular (véase el protocolo Wang y McManus JoVe15). Brevemente, MDL-helper, Rev-Helper, SVS-G-helper fueron transfectados a través de la precipitación de cloruro de calcio también de plásmidos hTERT o MyoD. Después de las 48 h, el sobrenadante fue recogido, y luego por tres días adicionales. Todo sobrenadante se concentró entonces por ultracentrifugación. A continuación, el pellet se resuspendó en el búfer Tris-HCL+NaCl+EDTA. La estimación del titer fue evaluada por el ensayo estándar de lentivirus qPCR.
  3. Uno o dos días más tarde, transfiera las células a una placa de 6 pozos y cultivarlas hasta alcanzar el 60-70% de confluencia.
  4. Complemente el medio fibroblasto con 1 μg/ml de puromicina y agregue 2 ml a cada pozo.
  5. Mantenga las celdas bajo selección hasta que todas las celdas del pozo de control estén muertas (hasta 12 días), cambiando los medios cada 2-3 días. Pasa las células del plato de 6 pozos a dos platos de 10 cmy 2 para una mayor proliferación.
  6. Congelar viales de fibroblastos después de la selección. Etiqueta como F(hTer).
  7. Fibroblastos que expresan hTERT de semillas (F(hTer)) con aproximadamente un 30% de confluencia en el medio fibroblasto, en dos pozos de una placa de 12 pozos, para tener alrededor del 50% de confluencia al día siguiente.
  8. Para la transducción del lentivirus, mezcle de 2 a 5 x 109 vg de MyoD-hygromycinB lentivirus en 400 μl de fibroblasto medio y añada a los pozos respectivos; al tercer pozo añadir 400 μl de fibroblasto medio. Añadir 1 ml de medio al día siguiente.
  9. Uno o dos días más tarde transfiere las células a una placa de 6 pozos y crece hasta un 60-70% de confluencia.
  10. Complemente el medio de crecimiento de fibroblastos con higromicina B (400 μg/ml) y agregue 2 ml a cada pozo.
  11. Mantenga las celdas bajo selección hasta que todas las celdas del pozo de control estén muertas (hasta 12 días), cambiando los medios cada 2-3 días.
  12. Congelar viales de fibroblastos después de la selección. Etiquetar como FM seguido por el número/nombre de identificación de la celda.

3. Protocolo de transdiferenciación

  1. Semilla transducida FM en 10 cm2 platos con 30-40% de confluencia. En una placa de 12 pozos, sembrar 6 x 104 células (esto depende de la línea celular individual).
    NOTA: Para la inmunodetención, las células de semillas en las cubiertas de vidrio o las toboganes de cámara recubiertas con Matrigel. Diluya Matrigel a la 1:10 en el medio DMEM, agregue un volumen suficiente para cubrir la superficie y deje que los toboganes se sienten a temperatura ambiente durante una hora. Aspirar justo antes de sembrar las células.
  2. Para la inducción de mioblastos, cuando los fibroblastos alcanzaron el 70% de confluencia(Figura 3A),enjuagar la superficie celular con PBS y añadir medios de mioblastos frescos complementados con doxycyclina fresca de 8 μg/ml.
    NOTA: El éxito de la diferenciación se ve comprometido más allá del 80% de confluencia.
  3. Después de dos o tres días después, las células son 90-95% confluentes y su morfología habrá cambiado (Figura 3B). Enjuague la superficie celular con PBS y agregue medios de diferenciación frescos complementados con doxycyclina fresca de 8 μg/ml.
  4. Continúe cambiando de medio cada 2-3 días sin pasar hasta que se establezcan los myotubes (confirmar a través de morfología) (Figura 3C).
  5. Siete a diez días después de comenzar la diferenciación de miotube, las células deben ser completamente diferenciadas y pueden comenzar a desprenderse o morir. Antes de que esto suceda, coseche los miotubes para su posterior análisis.
    NOTA: El curso de tiempo de la formación de miotube depende de la línea celular. Las mutaciones en proteínas relacionadas con el músculo pueden interferir en el potencial miogénico. Cuando los myotubes comienzan a aparecer brillantes y miran de blanco los bordes es una señal que están empezando a separar (Figura 4).
  6. Para cosechar miotubes, recoge los medios y transfiéralo a un tubo cónico de 50 ml. El medio puede contener miotubes que se han desprendido.
  7. Enjuague los myotubes con PBS de 5 ml y transfiera PBS al tubo de 50 ml.
  8. Añadir 3 ml de 0,25 % de trypsina a la superficie celular. Coloque el plato en la incubadora durante 5 minutos. Compruebe el plato debajo del microscopio para ver si las células están levantadas. Si no es así, colóquelo de nuevo en la incubadora durante 5 minutos adicionales.
  9. Una vez que las células estén separadas, agregue 7 ml de medios fibroblastos al plato y pipeta hacia arriba y hacia abajo para volver a usar las células. Recoja las células al tubo cónico de 50 ml.
  10. Centrífuga a 1.200 x g durante 7 min a 4 °C.
  11. Aspirar cuidadosamente fuera del líquido, sin perturbar el pellet. Guarde los pellets a -80 °C hasta su posterior procesamiento.

4. Inmunodetención de miotubes diferenciados

NOTA: Para la inmunodetención, haga crecer las células en manchas de vidrio o toboganes de cámara como se indicó anteriormente.

  1. Una vez que los miotubes están completamente diferenciados, aspirar fuera de los medios y enjuagar cuidadosamente las diapositivas con PBS. Aspirar PBS apagado.
  2. Añadir PFA fresco al 4% (500 μL por pozo de una placa de 12 pozos) e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Aspirar PFA apagado.
  3. Enjuague con 1 mL PBS.
  4. Incubar con glicina de 0,2 M a temperatura ambiente, durante 10 min. Aspirar glicina.
  5. Permeabilizar con PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL/pozo de una placa de 12 pozos), durante 10 min con agitación suave.
  6. Bloquee con 300 μL/pozo de solución de bloqueo, durante 10 minutos con agitación suave.
  7. Incubar con anticuerpo primario diluido 1:50 en 300 μL de solución de bloqueo, durante 2 horas a temperatura ambiente, con suave agitación.
  8. Enjuague tres veces con 1 mL/pozo de PBS durante 5 minutos, con suave agitación.
  9. Incubar con anticuerpo secundario diluido 1:500 en 300 μL de solución de bloqueo, durante 1 hora, a temperatura ambiente, con suave agitación. Cubra la placa con papel de aluminio.
  10. Enjuague tres veces con 1 mL/pozo de PBS durante 5 minutos, con suave agitación.
  11. Incubar con DAPI diluido en PBS durante 10 minutos. Enjuague tres veces con 1 mL/pozo de PBS.
  12. Agregue una gota de medio de montaje a una diapositiva de vidrio. Retire la tapa con fórceps y colóquela boca abajo en la caída del medio de montaje.
  13. Invierta el deslizamiento sobre una toalla de papel y presione suavemente para eliminar burbujas y el exceso de medio de montaje.
  14. Selle las diapositivas con esmalte de uñas y guárdelo a 4 °C hasta que se tocen las imágenes.

5. Transfección de oligonucleótidos antisense

NOTA: El protocolo a continuación es para la transfección de una placa de 6 pozos. Ajuste los volúmenes en consecuencia para placas más pequeñas o más grandes. La transfección se realiza en mioblastos 100% confluentes cuando las células están listas para el paso de diferenciación.

  1. Aspirar el medio de crecimiento de mioblast y enjuagar las células con 1 mL PBS.
  2. Añadir 500 μL/pozo de medios OptiMEM e incubar a 37 °C durante 1 hora.
  3. Diluir el oligonucleótido antisense (AON) en 100 μL de OptiMEM a la concentración final deseada (es decir, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    NOTA: Este protocolo está optimizado para AONs 2'ometil-fosforotioato.
  4. Mezclar la lipofectamina con OptiMEM (volumen final de 100 μL) para dar una relación final de 1:1 (ADN μg: lipofectamina μL). Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  5. Combine la lipofectamina diluida con el AON diluido. Mezcle suavemente pipeteando e incubando durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir una formación compleja. Evite las burbujas de aire.
  6. Añadir 200 μL de lipofectamina y mezcla de AON a los pozos respectivos. Incubar las células durante la noche a 37 °C, 5% CO2.
  7. Al día siguiente eliminar la mezcla de transfección y añadir 2 ml de medios de diferenciación caliente complementados con doxiciclina.
  8. Recoger células al menos tres días después para la extracción de ARN o de siete a 21 días en caso de análisis de proteínas.
    NOTA: Los días de diferenciación necesarios para detectar el ARN y/o la expresión proteica pueden variar en consecuencia según el gen de interés o la línea celular. En el caso de dmd,es posible detectar su ARNm en un plazo de tres días. La detección de proteínas de distrofina requiere al menos siete días. Esto variará dependiendo de la línea celular. Las altas concentraciones de AON y reactivo de transfección pueden afectar la transdiferenciación.

6. Transducción AAV1-U7

NOTA: Este protocolo fue optimizado para placas de 6 pozos. Ajuste los volúmenes proporcionalmente a la superficie de cultivo. La transducción se realiza en mioblastos 100% confluentes cuando las células están listas para el paso de diferenciación. AAV1 es el serotipo AAV con la mejor capacidad de transducción de mioblasts cultivados.

  1. Aspirar fuera del medio de crecimiento de mioblastos y enjuagar las células con 1 mL PBS.
  2. Diluir 0,5-1 x 1011 partículas virales de AAV1-U7 en 700 μL de medios de diferenciación cálidos complementados con doxiciclina.
    NOTA: Utilizamos qPCR para determinar la concentración viral. La cantidad de virus a utilizar puede variar dependiendo del método de cuantificación y debe determinarse previamente utilizando un ensayo de reportero.
  3. Añade la mezcla viral al pozo soltándola homogéneamente.
  4. Al día siguiente, añadir 1,3 ml de medios de diferenciación cálidos complementados con doxiciclina.
  5. Recoger las células al menos tres días después para la extracción de ARN o de siete a 21 días en caso de análisis de proteínas.

7. Extracción de ARN

NOTA: Todo el material utilizado durante este paso debe estar libre de RNase.

  1. Añadir 500 μL de TRIzol por pellet y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que las células se lilicen homogéneamente.
  2. Transfiera el lisato celular en un tubo de 1,5 ml e incubado durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  3. Añadir 100 μL de cloroformo y agitar manualmente durante 15 s. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  4. Centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Recoger la fase acuosa (superior) y transferirla a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  5. Para 1 volumen de la fase acuosa, agregue 1 volumen de etanol 100% y mezcle por pipeteo.
    NOTA: Recomendamos purificación y concentración de columnas.
  6. Transfiera la muestra a una columna IC Zymo-Spin en un tubo de recogida y centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través.
  7. Para la digestión DNase I en columna, prelavar la columna con 400 μL RNA Wash Buffer. Centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través.
  8. Prepare 40 μL de mezcla de reacción DNase por muestra. Mezclar 5 μL DNase I con 35 μL dna digestión buffer.
  9. Agregue la mezcla directamente a la matriz de columnas. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
  10. Agregue 400 μL RNA Prep Buffer a la columna y centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través.
  11. Añadir 700 μL RNA Wash Buffer a la columna y centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través.
  12. Añadir 400 μL RNA Wash Buffer a la columna y centrífuga a 12.000 x g durante 2 minutos para garantizar la eliminación completa del búfer de lavado. Transfiera la columna cuidadosamente a un tubo RNase-free de 1,5 ml.
  13. Agregue 15 μL de agua libre de nucleasa directamente a la matriz de columnas. Incubar durante 5 minutos y centrífuga a 12.000 x g durante 1 minuto.
    NOTA: Recoja el ARN eluted y aplíquelo de nuevo a la columna para aumentar el rendimiento. Centrífuga a 12.000 x g durante 1 minuto.
  14. Coloque muestras sobre hielo y cuantifique las muestras en un Nanodrop.
  15. Almacene muestras a -80 °C.

8. Análisis RT-PCR

NOTA: En este paso, presentamos una sugerencia de reactivos para detectar la expresión del ARNm de distrofina, pero se puede adaptar fácilmente a otros reactivos de elección.

  1. transcripción inversa
    1. Descongela todos los reactivos y mantenlos en hielo.
    2. Preparar una mezcla con 4 μL de 5x búfer de reacción, 2 μL de mezcla dNTP (10 mM), 1 μL de inhibidor ribolock RNase y 1 μL de RevertAid RT.
    3. Mezcle el tubo suavemente y centrífuga brevemente.
    4. En tubos PCR de 0,2 ml, añada el volumen adecuado de ARN para tener 1 μg por reacción. Añadir agua libre de nucleasa q.s.p 12 μL. Incluya un tubo sin la transcriptasa inversa como control negativo y un tubo con agua libre de nucleasa en lugar de ARN.
    5. Distribuya 8 μL de mezcla de reacción por tubo. El volumen total es de 20 μL.
    6. Coloque los tubos en un termociclo e incubar durante 5 minutos a 25 °C seguido de 60 min a 42 °C. Detenga la reacción calentando a 70 °C durante 5 minutos.
    7. Coloque los tubos sobre hielo o a -20 °C para mayor almacenamiento.
  2. PCR
    NOTA: Diseño de imprimaciones en cruces exons preferiblemente.
    1. Reactivos de vórtice y gire hacia abajo antes de su uso.
    2. Preparar una mezcla maestra utilizando 0,5 μL de imprimación hacia adelante (25 μM), 0,5 μL de imprimación inversa (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix y 8,5 μL de agua sin nucleasa por muestra.
    3. Aliquot 22 μL de mezcla maestra en un tubo para cada muestra.
    4. Añadir 3 μL de cDNA (150 ng) a su tubo PCR respectivo. Añadir 3 μL de agua libre de nucleasa al tubo de control negativo PCR.
    5. Vórtice y girar por los tubos PCR.
    6. Incubar los tubos en un termociclo a 95 °C durante 3 min, 95 °C para 30 s, (Tm-5) °C para 30 s, 72 °C para (1 min/kb) 34 veces, 72 °C durante 5 minutos.
      NOTA: La temperatura óptima de recocido se puede determinar empíricamente. Para la mezcla maestra sugerida, reste 5 °C de la temperatura de fusión de imprimación.
    7. Cargue 12 μL de la reacción PCR en un gel de agarose y congele las muestras a -20 °C.

9. Detección de la expresión de distrofina por Western Blotting

NOTA: Este protocolo está optimizado para la distrofina, una gran proteína de membrana. Pueden ser necesarias condiciones específicas para diferentes proteínas.

  1. Extracción de proteínas
    1. Después de 7-21 días de diferenciación, recoger células con 5 ml de PBS con 100 μL 0.5 M EDTA, y 50 μL inhibidores de la proteasa. Incubar a 37 °C hasta que las células se desprendan. Centrífuga a 1.200 x g durante 5 min a 4 °C. Enganche el pellet sumergiendo el tubo en nitrógeno líquido. Almacene el pellet a -80 °C o continúe con el paso de lisis.
    2. Preparar el búfer de lisis añadiendo 1% de digitonina, 1% inhibidor de la proteasa, 10% inhibidor de la fosfatasa, y buffer base al volumen total (60 μL por pellet celular).
    3. Agregue 60 μL de tampón de lisis al pellet celular, sobre hielo. Sonicate por 5 s. Deja reposar en hielo durante 8 s. Repita los pasos de sonicación y descanso dos veces.
    4. Incuba muestras en hielo durante 30 minutos.
    5. Centrífuga a 14.000 x g durante 20 min a 4 °C.
    6. Transfiera el sobrenadante a tubos limpios.
    7. Cuantificar muestras por ensayo de ácido bicinchoninic (BCA), siguiendo las instrucciones del fabricante.
    8. Mezcle la solución proteica con el volumen adecuado del búfer Laemmli. Hacer coácuotas de 100 μg. Si es necesario, ajuste el volumen a 25 μl con el búfer de lisis base. Almacene muestras a -80 °C.
  2. Hinchazón occidental
    1. Descongelar muestras en hielo.
    2. Desenvríe las muestras a 100 °C durante 5 minutos, luego enfríe en hielo, gire hacia abajo.
    3. Diluir el amortiguador de funcionamiento 20X Tris-acetato SDS en 200 ml dH2O y añadir 500 μL antioxidante.
    4. Prepare el gel de poliacrilamida tris-acetato del 3-8% quitando el peine y enjuagando con dH2O. Montar el gel en el aparato de electroforesis. Llene la cámara interna con el búfer en ejecución.
    5. Cargue 5 μL de escalera proteica y 25 μL de muestra en el gel. Llene la cámara externa con el búfer en ejecución.
    6. Correr a 80 V durante 1 h a 4 °C. Luego, a 120 V por 2 h a 4 °C.
    7. Prepare 3 L de búfer de transferencia 1X con 150 ml de metanol de 20X, 150 ml de búfer de transferencia de 20X y 2.700 ml de dH2O. Enfríe hasta 4 °C.
    8. Corte 4 trozos de papel filtrante y un trozo de membrana nitrocelulosa. Remoje el filtro de papel y la membrana en una bandeja con búfer de transferencia.
    9. Retire suavemente el gel de la caja y ensérrelo en el aparato de transferencia con papel de filtro, membrana y esponjas. El gel se coloca en el lado negativo y la membrana en el lado positivo.
    10. Ejecute la transferencia a 300 mA, revolviendo, a 4 °C, durante la noche.
    11. Bloquee la membrana en 10 ml de amortiguador de bloqueo durante 1 h con agitación suave, a temperatura ambiente.
    12. Preparar la solución de anticuerpos primarios con 10 ml de búfer de bloqueo y 50 μL de anticuerpo de distrofina (1:200).
    13. Deseche el búfer de bloqueo y agregue la solución de anticuerpos principal. Incubar con agitación suave durante al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
    14. Enjuague la membrana tres veces con 0.1% PBS de interpolación, durante 5 minutos con agitación suave.
    15. Preparar solución secundaria de anticuerpos utilizando 10 ml de solución de bloqueo, 2 μL de anticuerpo anti-conejo (1:5000) y 20 μL de 0,2% de interpolación.
    16. Agregue la solución secundaria de anticuerpos a la membrana. Incubar durante 1 h con agitación suave, cubierto con papel de aluminio para proteger de la luz.
    17. Deseche la solución de anticuerpos y enjuague la membrana 3 veces con 0.1% Tween PBS, durante 5 minutos con agitación suave, protegido de la luz.
    18. Exposición e imagen de la membrana en un dispositivo de imágenes.
    19. Manchar la membrana para la proteína total con la mancha total de proteína Revert 700, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: La detección de distrofina por hinchazón occidental depende de la edad/mutación del paciente y la capacidad de la célula para fusionarse y permanecer unido suficiente tiempo para acumular suficiente distrofina.

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Resultados

Este protocolo muestra cómo establecer cultivos de fibroblastos derivados de la piel humana y convertirlos en mioblastos y luego en miotubes diferenciados. Este tipo de línea celular es extremadamente útil para el estudio de trastornos neuromusculares y pruebas in vitro de terapias potenciales.

Se muestra una representación esquemática de la conversión fibroblasta en la figura 1. La Figura 2A muestra un fragmento de piel y lo...

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Discusión

Para obtener líneas celulares FM con buena calidad, algunos pasos son críticos. Cuanto antes se procese la biopsia de la piel, mayores serán las posibilidades de obtener fibroblastos sanos. El número de pasajes de cultivos de fibroblastos también es importante. Las células primarias tienen una capacidad proliferativa limitada y después de muchos pasajes, entran en senescencia replicativa. Por lo tanto, es mejor tener un stock de fibroblastos en un número de paso bajo y transformar las células en el paso más temprano posi...

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Divulgaciones

El Hospital Nacional de Niños ha autorizado el programa de saltos exon 2 descrito aquí a Audentes Therapeutics. K.M.F. y N.W. han recibido pagos de regalías como resultado de esta licencia.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias al Dr. Vincent Mouly por compartir sus conocimientos en el pasado con respecto al modelo. Este trabajo ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Salud del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Estados Unidos (R01 NS043264 (K.M.F., y R.B.W.)), el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticos y cutáneas (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., y N.W.). N.W. ha recibido apoyo de becas de la Universidad Estatal de Ohio/Nationwide Children's Hospital Muscle Group y la Fundación Philippe. Este trabajo también fue apoyado por fondos discrecionales internos y parte de la obra de salto exon 2 ha sido apoyada también por CureDuchenne (K.M.F.) y la Asociación Francaise Contre Les Myopathies. Número IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS000000123.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Plato de 100 mmCorning430167
0,25% Tripsina-EDTA, rojo fenolThermo Fisher2500056
10X Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Fisher ScientificBP3994
Placa de 12 pocillosCorning3513
20X Tampón de transferenciaThermo FisherNP00061
20X Tris-acetato SDS tampón de funcionamientoThermo FisherLA0041
3-8% Gel de acetato de trisThermo FisherEA0378BOX
matraz de 75 cm2Corning430641U
Antibiótico-Antimicótico 100XThermo Fisher15240062
Cadena pesada anti-miosina, anticuerpo de sarcómeroEstudios de desarrollo Banco de hibridadoresMF20 sobrenadanteDilución 1:50
AntioxidanteThermo FisherNP0005
BCA Ensayo de proteínasThermo Fisher23227
CloroformoSigma-AldrichC2432
DAPIThermo FisherD3571Dilución 1:1000
DigitoninMillipore Sigma300410250MG
DimetilsulfóxidoSigma-AldrichD2438
DMEM, Alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvatoThermo Fisher10569044
DNAse I set (250U)Zymo Research CorporationE1010
Clorhidrato de doxiciclinaFisher ScientificBP2653-5
Dup2 imprimadores humanosFw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG
TTTCTC 3'Rv_5		' CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'Anticuerpo contra la
distrofinaAbcamab15277Dilución 1:200
Suero fetal bovinoThermo Fisher16000
GlycineSigma-AldrichG8898
Cabra anti-ratón, Alexa Fluor 488Thermo FisherA11001Dilución 1:1000
Halt Cóctel inhibidor de la proteasa 100XThermo Fisher78430
HemocitómetroHausser Scientific3100
Higromicina BThermo Fisher10687010
IRDye 680RD anti-Conejo de cabra IgG (H+L)Li-Cor926-68071Dilución 1:5000
Lab-Tek II Sistema de correderas de cámara CC2Thermo Fisher15852
LaemmliBioworld105700201
Lipofectamina 3000 Reactivo de transfecciónThermo FisherL3000008
Matrigel Matriz de membrana GFRCorning354230
MetanolFisher ScientificA412P-4
Mr. Frosty Contenedor de congelaciónThermo Fisher51000001
Membrana de nitrocelulosa 0,45 µ mGE Healthcare Life Sciences10600002
Control normal del suero de cabraThermo Fisher10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)Li-Cor927-40003Tampón de bloqueo para Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher11058021
ParaformaldehídoSigma-Aldrich158127
Mezcla maestra de PCRThermo FisherK0172
Inhibidor de la fosfatasaThermo FisherA32957
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio Rad1610374
PuromycinThermo FisherA1113803
Revert 700 Tinción de proteína total para la normalización de Western BlotLi-Cor926-11021
RevertAid kitThermo FisherK1691
RNA Clean & Concentrador-25Zymo Research CorporationR1018
BisturíesAspen Quirúrgico372611
Medio de diferenciación de células musculares esqueléticasPromocellC23061
Medio de crecimiento de células musculares esqueléticasPromocellC23060
Triton X-100Acros Organics
reactivoTRIzolThermo Fisher15596026
Tween 20Fisher ScientificBP337500
Congelador de temperatura ultrabajaThermo Scientific7402
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher15575020
Vectashield medio de montaje antidecoloraciónVector LabsH1000
215682500

Referencias

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  5. Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
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