El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada paso a paso para el montaje de construcciones multigénicos utilizando el sistema de clonación modular basado en la clonación Golden Gate. También ofrece recomendaciones sobre pasos críticos para garantizar un montaje óptimo basado en nuestras experiencias.
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Artículo de método
Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate
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Resumen
Resumen
El método de clonación Golden Gate permite el montaje rápido de múltiples genes en cualquier disposición definida por el usuario. Utiliza enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera de sus sitios de reconocimiento y crean un voladizo corto. Este sistema modular de clonación (MoClo) utiliza un flujo de trabajo jerárquico en el que diferentes partes del ADN, como promotores, secuencias de codificación (CDS) y terminadores, se clonan primero en un vector de entrada. A continuación, se ensamblan varios vectores de entrada en unidades de transcripción. Varias unidades de transcripción se conectan a un plásmido multigénico. La estrategia de clonación golden gate es de enorme ventaja porque permite un montaje sin cicatrices, direccional y modular en una reacción de una olla. El flujo de trabajo jerárquico normalmente permite la clonación fácil de una gran variedad de construcciones multigénicas sin necesidad de secuenciar más allá de los vectores de entrada. El uso de deserción de proteínas fluorescentes permite una fácil detección visual. Este trabajo proporciona un protocolo detallado paso a paso para el montaje de plásmidos multigéneros utilizando el kit de clonación modular de levadura (MoClo). Mostramos resultados óptimos y subóptimos del ensamblaje plásmido multigéneo y proporcionamos una guía para la detección de colonias. Esta estrategia de clonación es altamente aplicable para la ingeniería metabólica de levaduras y otras situaciones en las que se requiere clonación de plásmidos multi genes.
Introducción
La biología sintética tiene como objetivo diseñar sistemas biológicos con nuevas funcionalidades útiles para las industrias farmacéutica, agrícola y química. Ensamblar un gran número de fragmentos de ADN de una manera de alto rendimiento es una tecnología fundamental en biología sintética. Un proceso tan complicado puede dividirse en múltiples niveles con una complejidad decreciente, un concepto tomado de las ciencias básicas de la ingeniería1,2. En biología sintética, los fragmentos de ADN suelen ensamblarse jerárquicamente en función de la funcionalidad: (i) Nivel de pieza: "partes" se refiere a fragmentos d....
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Protocolo
NOTA: El protocolo jerárquico de clonación que se ofrece en este kit de herramientas se puede dividir en tres pasos principales: 1. Clonación de plásmidos de piezas; 2. Clonación de unidades de transcripción (TUs); 3. Clonación de plásmidos multigénicos (Figura 1). Este protocolo parte del diseño de la imprimación y termina con las aplicaciones del plásmido multigénico clonado.
1. Diseño de imprimación para clonar el plásmido de la pieza (pYTK001):
- Diseñe las imprimaciones delanteras e inversas que contengan nucleótidos flanqueantes TTT al final de 5', un sitio de reconocimiento BsmBI con un nucleótid....
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Resultados
Aquí los resultados de cuatro plásmidos multigéneros replicativos para la producción de β caroteno (amarillo) y licopeno (rojo). Se construyó un plásmido multigénico integrador para interrumpir el locus ADE2, las colonias de las cuales son rojas.
Clonación de CDS en el vector de entrada (pYTK001)
ERG20 se amplió desde el genoma de la levadura y los tres genes carotenoides crtE, .......
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Discusión
El kit de clonación basado en MoClo desarrollado por Lee et al. proporciona un excelente recurso para el montaje rápido de una a cinco unidades de transcripción en un plásmido multigéneros, ya sea para replicación o integración en el genoma de la levadura. El uso de este kit elimina el cuello de botella de clonación que consume mucho tiempo y que con frecuencia existe para expresar múltiples genes en levadura.
Probamos cinco condiciones diferentes para los ciclos de digestión/ligadura de la cl.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Research Foundation para la Universidad Estatal de Nueva York (Premio #: 71272) y el Premio IMPACT de la Universidad en Buffalo (Premio #: 000077).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,5 mm Perlas de vidrio | RPI research products | 9831 | Para lisar células de levadura |
| Bacto Agar | BD & Empresa | 214010 | Componente de la levadura medio sintético completo (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Empresa | 211677 | Componente del extracto de levadura medio de peptona dextrosa (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | , una versión altamente eficiente de la enzima de restricción BsaI |
| Carbenicillina | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiótico para el cribado a nivel de la unidad de transcripción |
| Cloranfenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiótico para el cribado en el nivel de vector de entrada |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Suplemento de aminoácidos de la levadura medio sintético completo (CSM) |
| Dextrosa | Fisher Chemical | D16-500 | Fuente de carbono de la levadura medio sintético completo (CSM) |
| Difco Levadura Base de nitrógeno sin aminoácidos | BD & Empresa | 291940 | Fuente de nitrógeno de la levadura medio sintético completo (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs para PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | un isoesquizomero altamente eficiente de BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | Para la transformación |
| levaduras Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | Para la extracción de carotenoides de células de levadura |
| Kanamicina | Bioreactivos Fisher | 25389-94-0 | Antibiótico para el cribado a nivel de plásmidos multigénicos |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 Medio de | agar lisogénico para E. coli |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Medio líquido lisogénico para E. coli |
| cultivo de licopeno | químicos de las Islas Caimán | NC1142173 | Para la cuantificación de licopeno |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Laboratorio de depósito: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | Para la purificación de plásmidos de E.coli |
| Nanodrop Espectrofotómetro | Thermo Scientific | ND2000c | Para medir concentraciones precisas de ADN |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Enzima de restricción para la linealización integrativa de plásmidos multigénicos |
| Sulfato de nurseotricina | Goldbio | N-500-100 | Marcador de selección de antibióticos para el plásmido pCAS utilizado en este estudio |
| Tampón de reacción Phusion HF (5X) | Tampón B0518S | New England Biolabs | para PCR con polimerasa Phusion |
| Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad | New England Biolabs | M0530S | Polimerasa de alta fidelidad para todas las reacciones de PCR |
| pLM494 | Addgene | 100539 | plásmido utilizado para amplificar crtI, crtYB y crtE utilizado en este estudio |
| Cubeta de cuarzo | Thermo Electron | 10050801 | Para cuantificar carotenoides |
| T4 ligasa | New England Biolabs | M0202S | Ligasa para dorado Clonación de puerta |
| Termociclador | BIO-RAD | 1851148 | Para realizar todas las reacciones de PCR y clonación |
| Homogeneizador | de tejidos Bullet Blender | Modelo: BBX24 | Para la homogeneización de células de levadura |
| Espectrofotómetro UV-Vis | Thermo Scientific | Genesys 150 | Para la cuantificación de carotenoides |
| Extracto de levadura | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Componente del extracto de levadura medio peptona dextrosa (YPD) |
| β-caroteno | Alfa Aesar AAH6010603 | Para la cuantificación de β-caroteno |
Referencias
- Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553(2009).
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Reimpresiones y permisos
