Method Article

Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

DOI:

10.3791/61993

⸱

February 5th, 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University at Buffalo, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada paso a paso para el montaje de construcciones multigénicos utilizando el sistema de clonación modular basado en la clonación Golden Gate. También ofrece recomendaciones sobre pasos críticos para garantizar un montaje óptimo basado en nuestras experiencias.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método de clonación Golden Gate permite el montaje rápido de múltiples genes en cualquier disposición definida por el usuario. Utiliza enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera de sus sitios de reconocimiento y crean un voladizo corto. Este sistema modular de clonación (MoClo) utiliza un flujo de trabajo jerárquico en el que diferentes partes del ADN, como promotores, secuencias de codificación (CDS) y terminadores, se clonan primero en un vector de entrada. A continuación, se ensamblan varios vectores de entrada en unidades de transcripción. Varias unidades de transcripción se conectan a un plásmido multigénico. La estrategia de clonación golden gate es de enorme ventaja porque permite un montaje sin cicatrices, direccional y modular en una reacción de una olla. El flujo de trabajo jerárquico normalmente permite la clonación fácil de una gran variedad de construcciones multigénicas sin necesidad de secuenciar más allá de los vectores de entrada. El uso de deserción de proteínas fluorescentes permite una fácil detección visual. Este trabajo proporciona un protocolo detallado paso a paso para el montaje de plásmidos multigéneros utilizando el kit de clonación modular de levadura (MoClo). Mostramos resultados óptimos y subóptimos del ensamblaje plásmido multigéneo y proporcionamos una guía para la detección de colonias. Esta estrategia de clonación es altamente aplicable para la ingeniería metabólica de levaduras y otras situaciones en las que se requiere clonación de plásmidos multi genes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La biología sintética tiene como objetivo diseñar sistemas biológicos con nuevas funcionalidades útiles para las industrias farmacéutica, agrícola y química. Ensamblar un gran número de fragmentos de ADN de una manera de alto rendimiento es una tecnología fundamental en biología sintética. Un proceso tan complicado puede dividirse en múltiples niveles con una complejidad decreciente, un concepto tomado de las ciencias básicas de la ingeniería1,2. En biología sintética, los fragmentos de ADN suelen ensamblarse jerárquicamente en función de la funcionalidad: (i) Nivel de pieza: "partes" se refiere a fragmentos de ADN con una función específica, como un promotor, una secuencia de codificación, un terminador, un origen de replicación; (ii) Nivel de unidades de transcripción (TU): un TU consiste en un promotor, una secuencia de codificación y un terminador capaz de transcribir un solo gen; (iii) Nivel multigénico: un plásmido multigénico contiene múltiples TUs que con frecuencia se componen de una vía metabólica completa. Este montaje jerárquico pionero por la comunidad BioBrick es el concepto fundamental para el montaje de grandes conjuntos de DNAs en biología sintética3.

En la última década4,5,6,7, la técnica de clonación Golden Gate ha facilitado significativamente el montaje jerárquico de ADN2. Muchos otros métodos de clonación de varias partes, como la clonación gibson8,clonación independiente de ligadura (SLIC)9,clonación basada en la escisión de uracil (USUARIO)10,la reacción de ciclismo de ligasa (LCR)11,y la recombinación in vivo (ensamblador de ADN)12,13,también se han desarrollado hasta ahora. Pero la clonación de Golden Gate es un método de ensamblaje de ADN ideal porque es independiente de secuencias específicas de genes, lo que permite un montaje sin cicatrices, direccional y modular en una reacción de una sola olla. La clonación golden gate aprovecha las enzimas de restricción de tipo IIS que reconocen una secuencia no palindrómica para crear voladizos escalonados fuera del sitio de reconocimiento2. A continuación, un ligase se une a los fragmentos de ADN recocido para obtener un ensamblaje de varias partes. La aplicación de esta estrategia de clonación al sistema de clonación modular (MoClo) ha permitido el montaje de hasta 10 fragmentos de ADN con más del 90% de transformadores proyectados que contienen la construcción correctamente montada4.

El sistema MoClo ofrece enormes ventajas que han acelerado el ciclo de diseño-construcción-prueba de biología sintética. En primer lugar, las piezas intercambiables permiten la clonación combinatoria para probar rápidamente un gran espacio de parámetros. Por ejemplo, la optimización de una vía metabólica generalmente requiere recorrer en bicicleta muchos promotores de cada gen para equilibrar el flujo de la vía. El sistema MoClo puede manejar fácilmente tareas de clonación tan exigentes. En segundo lugar, es necesario secuenciar la parte plásmida, pero normalmente no la TU o los plásmidos multigénicos. En la mayoría de los casos, el cribado por PCR de colonia o la digestión de restricción es suficiente para la verificación a nivel de TU y plásmido multigénico. Esto se debe a que la clonación del plásmido de la pieza es el único paso que requiere PCR, que con frecuencia introduce mutaciones. En tercer lugar, el sistema MoClo es ideal para construir vías metabólicas complejas multigénero. Por último, debido a los voladizos universales, los plásmidos de la parte se pueden reutilizar y compartir con toda la comunidad de bioingeniería. Actualmente, los kits MoClo están disponibles para plantas14,15,5,16,17,hongos6,18,19,20,21,22,bacterias7,23,24,25,26,27y animales28,29. Recientemente también se ha introducido una plataforma MoClo de variosreinos.

Para Saccharomyces cerevisiae,Lee et al.6 han desarrollado un versátil kit de herramientas MoClo, un excelente recurso para la comunidad de biología sintética de levadura. Este kit viene en un formato conveniente de 96 pozos y define ocho tipos de piezas de ADN intercambiables con una colección diversa de promotores bien caracterizados, proteínas fluorescentes, terminadores, etiquetas de péptido, marcadores de selección, origen de replicación y herramientas de edición del genoma. Este kit de herramientas permite el montaje de hasta cinco unidades de transcripción en un plásmido multigénico. Estas características son valiosas para la ingeniería metabólica de levadura, en la que las vías parciales o enteras se expresan en exceso para producir productos químicos dirigidos. Con este kit, los investigadores han optimizado la producción de geraniol, linalool31,penicilina32,ácido muconico33,índigo34y betalain35 en levadura.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para guiar el uso del kit de herramientas MoClo para generar vías multigénero para la expresión episomal o genómica. A través del uso extensivo de este kit, hemos encontrado que la medición precisa de las concentraciones de ADN es clave para garantizar la distribución equimolar de cada parte en la reacción de Golden Gate. También recomendamos el ligase de ADN T4 sobre el ligase de ADN T7 porque el primero funciona mejor con un mayor número de voladizos36. Por último, cualquier sitio de reconocimiento interno de BsmBI y BsaI debe ser eliminado o domesticado antes del montaje. Alternativamente, uno puede considerar sintetizar piezas para eliminar varios sitios internos y lograr la optimización simultánea del codón. Demostramos cómo utilizar este kit de herramientas expresando una vía de cinco genes para la producción de β caroteno y licopeno en S. cerevisiae. Además, mostramos cómo noquear el locus ADE2 usando las herramientas de edición del genoma de este kit. Estos experimentos basados en colores fueron seleccionados para facilitar la visualización. También demostramos cómo generar proteínas de fusión y crear mutaciones de aminoácidos usando la clonación golden gate.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: El protocolo jerárquico de clonación que se ofrece en este kit de herramientas se puede dividir en tres pasos principales: 1. Clonación de plásmidos de piezas; 2. Clonación de unidades de transcripción (TUs); 3. Clonación de plásmidos multigénicos (Figura 1). Este protocolo parte del diseño de la imprimación y termina con las aplicaciones del plásmido multigénico clonado.

1. Diseño de imprimación para clonar el plásmido de la pieza (pYTK001):

  1. Diseñe las imprimaciones delanteras e inversas que contengan nucleótidos flanqueantes TTT al final de 5', un sitio de reconocimiento BsmBI con un nucleótido adicional (CGTCTCN), un voladizo de 4 nucleótidos (nt) (TCGG) complementario al del vector de entrada, un sitio de reconocimiento BsaI con un nucleótido adicional (GGTCTCN) y un voladizo específico de la pieza de 4 nt, además de la secuencia específica de la plantilla (Figura 2A). GoldenBraid 4.037 y GoldenMutagenesis38 son algunos de los software en línea que se pueden utilizar para el diseño de imprimación específico golden gate.
  2. Si los sitios de reconocimiento BsaI o BsmBI están presentes en cualquier parte, utilice un paso de domesticación para mutar estos sitios antes del ensamblado Golden Gate39. Para plásmidos integrativos (ver paso 4), nacionaliza cualquier sitio de reconocimiento de NotI. Para domesticar una pieza con un sitio de reconocimiento indeseable, divida la pieza en dos subpartes cerca del sitio indeseable (Figura 2A):
    1. Diseñe la imprimación delantera de la primera subparte de la misma manera que en el paso 1.1. pero diseñe la imprimación inversa con el sitio BsmBI y un voladizo específico del gen de 4 nt solamente.
    2. Diseñe la segunda imprimación delantera de sub-parte con el sitio BsmBI y el voladizo específico del gen de 4 nt solo que se superponga con la imprimación inversa de la primera sub-parte. Diseñe la imprimación inversa de la segunda subclave de la misma manera que en el paso 1.1.
    3. Introduzca las mutaciones deseadas en el reverso (para el paso 1.2.1) o en la imprimación delantera (paso 1.2.2) en la región específica del gen de la imprimación.
      NOTA: Alternativamente, una pieza optimizada para BsmBI y BsaI y codón se puede sintetizar comercialmente. Para secuencias de codificación (CDS), una mutación sinónimo se puede incorporar fácilmente en el tercer nucleótido de un codón de aminoácidos. Para promotores y terminadores, sin embargo, se recomienda comprobar la actividad mutada del promotor o terminador utilizando un ensayo de reportero39. Si hay un sitio de restricción indeseable hacia el final de la secuencia, se puede mutar utilizando una imprimación inversa más larga. Si hay varios sitios indeseables, se puede realizar mutagénesis dirigida por el sitio que permite mutar varios sitios40.
  3. Ocasionalmente, es deseable fusionar dos proteínas como una sola pieza con un vinculador en el medio(Figura 2A). El vinculador ayuda a garantizar la integridad estructural de las dos proteínas individuales41.
    1. La imprimación delantera para el primer gen es la misma que en el paso 1.1. En la imprimación inversa, incluya un sitio BsmBI, un voladizo específico del gen de 4 nt y una secuencia de vinculador. El voladizo de 4 nt puede ser el vinculador o los primeros nucleótidos del segundo gen.
    2. Para el segundo gen, diseñe la imprimación delantera de tal manera que tenga un sitio de reconocimiento BsmBI y un voladizo de 4 nt complementario al de la imprimación inversa del primer gen. Diseñe la imprimación inversa del segundo gen como en el paso 1.1.
  4. Para amplificar las partes por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)42, utilice una polimerasa de ADN de alta fidelidad para amplificar las partes de un ADN genómico, un CDNA o un plásmido. Compruebe el producto PCR en un gel de agarose del 1% seguido de purificación de gel. Se recomienda encarecidamente el uso de ADN purificado, si la purificación de gel es laboriosa, utilizar al menos una columna de espín para purificar el producto PCR.

2. Clonación de piezas en el vector de entrada (pYTK001) para crear plásmidos de pieza (Figura 2B)

  1. Para configurar la mezcla de reacción Golden Gate, añadir 20 fmol de cada producto PCR y el vector de entrada (pYTK001), 1 μL de 10X T4 t4 tampón de ligase, 0,5 μL de Esp3I (un isosquizomero altamente eficiente de BsmBI) y 0,5 μL de ligase T4. Añadir ddH2O para llevar el volumen total a 10 μL.
  2. Para configurar la reacción de clonación, ejecute el siguiente programa en un termociclo: 25-35 ciclos de 37 °C durante 5 min (digestión) y 16 °C durante 5 min (ligadura), seguido de una digestión final a 50 °C durante 10 minutos e inactivación enzimática a 80 °C durante 10 minutos.
    NOTA: Se recomiendan 35 ciclos de digestión/ligadura al clonar múltiples piezas de ADN en el vector de entrada simultáneamente, por ejemplo, durante la clonación de genes de fusión o domesticar un gen.
  3. Transforme toda la mezcla de reacción en la cepa DH5α o células equivalentes de Escherichia coli químicamente competentes por choque térmico. Se recomienda transformar todo el producto clonado de 10 μL en células E. coli químicamente competentes de 35 μL (2 X10 5 cfu/ml, cfu a partir de transformar 5 ng pYTK001 en 100 μL de las células competentes). Extender sobre una placa de caldo de lisogéneo (LB) con 35 μg/ml de cloranfenicol (Cm). Incubar a 37 °C durante la noche.
  4. Después de 16-18 h, saque la placa de la incubadora y mantenga la placa a 4 °C durante aproximadamente 5 h para permitir que la súper carpeta verde proteína fluorescente (sfGFP) se desarrolle para un color verde más intenso.
  5. Para facilitar la detección, coloque la placa en un ultravioleta (UV) o en un transilluminador de luz azul. El sfGFP que contiene colonias fluorescencia bajo la luz UV.
  6. Las colonias verdes son negativas porque contienen el pYTK001 sin cortar. Las colonias blancas son probablemente positivas. La clonación suele tener éxito si hay ~30-100% colonias blancas. Realizar más cribado de algunas colonias blancas por pcr de colonia o digestión de restricción (enzima sugerida: BsaI-HFv2).
  7. Purificar plásmidos de algunas de las colonias potencialmente correctas y confirmar las secuencias por secuencias de Sanger.

3. Montaje de plásmidos de piezas en plásmidos "casete"

NOTA: Un plásmido de casete contiene una unidad de transcripción definida por el usuario (TU) que consta de un promotor, un CDS y un terminador. Un plásmido de casete permite la expresión de un solo gen. Si los plásmidos de casete se ensamblarán en un plásmido multigénico, entonces el primer paso es determinar el número y el orden de las TUs en el plásmido multi gen. Estos determinarán qué conectores utilizar en los plásmidos de casete ya que los conectores vinculan las TUs en el plásmido multigénico. El primer conector izquierdo de TU debe ser ConLS, y el conector derecho del último TU debe ser ConRE. Se solaparán con ConLS' y ConRE' de plásmidos multigénero. El resto de los conectores deben estar en el orden numérico creciente. Por ejemplo, si el plásmido multigénero contiene cuatro TU, las combinaciones de conectores serían ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 y ConL3-TU4-ConRE (Figura 1).

  1. Antes de montar unidades de transcripción, se recomienda montar un vector intermedio con las siguientes seis partes: el conector izquierdo, la deserción sfGFP (pYTK047), el conector derecho, un marcador de selección de levadura, un origen de levadura de replicación y la pieza plásmida con un mRFP1, un origen E. coli y el gen resistente a la ampicilina (pYTK083) (Figura 3).
    1. Purificar los seis plásmidos anteriores. Registre sus concentraciones utilizando un espectrofotómetro UV-Vis o un ensayo basado en fluorescencia y diluya cada plásmido con ddH2O para que 1 μL tenga 20 fmol de ADN. Calcule la concentración molar de ADN mediante una calculadora en línea.
      NOTA: Es muy importante medir las concentraciones de ADN con precisión y canalizar con precisión para que el ensamblaje funcione, especialmente para ensamblajes con plásmidos de cinco a siete partes. Pequeños errores en la concentración de ADN de cada plásmido pueden causar una disminución significativa en la eficiencia de clonación.
    2. Añadir 1 μL de cada plásmido, 1 μL de 10X T4 tampón de ligasa, 0,5 μL de BsaI-HFv2 (una versión altamente eficiente de BsaI) y 0,5 μL de ligase T4. Suba el volumen a 10 μL añadiendo ddH2O.
    3. Para configurar la reacción de clonación, ejecute el siguiente programa en el termociclo: 25-35 ciclos de 37 °C durante 5 min (digestión) y 16 °C durante 5 min (ligadura). Omita los pasos finales de digestión e inactivación de calor, ya que los sitios BsaI deben conservarse en el vector intermedio (Figura 3).
    4. Transforme toda la mezcla de reacción en la cepa DH5α u otras células competentes de E. coli. Extender en una placa LB con 50 μg/mL de carbenicilina (Cb) o ampicilina. Incubar a 37 °C durante la noche.
      NOTA: Carbenicilina es un análogo estable de ampicilina.
    5. Después de 16-18 h, saque el plato de la incubadora. La placa contendrá colonias de color rojo pálido y verde pálido(Figuras 6C y 6D). Mantenga la placa a 4 °C durante aproximadamente 5 h para que el mRFP1 y el sfGFP maduren. Utilice un uv o un transilluminador de luz azul para identificar las colonias verdes, que contienen el vector intermedio potencialmente correcto.
    6. Vete las colonias verdes en una placa LB + Cb e incuba a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, salga de nuevo en una placa LB + Cm e incuba a 37 °C durante la noche. Las colonias que crecen en placas LB + Cm contienen plásmidos desensamblados porque se conservan vectores de piezas resistentes a cm.
    7. Elija las colonias que no crecen en la placa LB + Cm y realice digestións de restricción (enzimas sugeridas: BsaI-HFv2, Esp3I) para confirmar el plásmido correctamente ensamblado. Alternativamente, utilice pcr de colonia para la detección.
  2. Una vez que el vector intermedio se ha montado correctamente, el siguiente paso es ensamblar unidades de transcripción. Este es un ensamblaje de 4 piezas con las siguientes partes: el vector intermedio, un promotor, un CDS y un terminador.
    1. Purificar los plásmidos de cuatro partes. Registre sus concentraciones y diluya cada uno de los plásmidos para que 1 μL tenga 20 fmol de ADN.
    2. Para configurar la mezcla de reacción, siga el paso 3.1.2.
    3. Para configurar la reacción de clonación, siga el paso 2.2.
    4. Transforme toda la mezcla de reacción de clonación en las células y placas competentes de DH5α o E. coli equivalentes en LB + Cb. Incubar a 37 °C durante la noche.
    5. Después de 16-18 h, saque el plato de la incubadora. Aparecerán colonias blancas y verdes pálidas(Figuras 6E y 6F). Mantenga la placa a 4 °C durante aproximadamente 5 h para que el sfGFP madure. Utilice un uv o un transilluminador de luz azul para identificar las colonias blancas no fluorescentes. Estos contienen las unidades de transcripción potencialmente correctas.
    6. Salen y crecen 8-10 colonias blancas y realizan una colonia PCR. Purificar plásmidos de las colonias que dan positivo desde la colonia PCR. Llevar a cabo la digestión de restricción (enzima sugerida: Esp3I) para confirmar aún más el ensamblaje.
      NOTA: Las unidades de transcripción de secuenciación normalmente no son necesarias porque la clonación implica sólo digestión de restricción y ligadura. Todas las secuencias de interés se han confirmado a nivel de plásmido parcial.

4. Montaje de plásmidos de casete en plásmidos "multigénicos":

NOTA: Los plásmidos multigénicos permiten la expresión de más de un gen. Dependiendo de la aplicación posterior, los plásmidos multigénicos podrían ser replicativos o integrativos. Los plásmidos replicativos tienen el origen de levadura de la replicación; por lo tanto, se puede mantener establemente cuando la célula de levadura se divide. Los plásmidos integrativos no tienen el origen de levadura de la replicación. En su lugar, tienen brazos homológicos de 5' y 3' que permiten la integración de múltiples genes en loci específicos del genoma a través de la recombinación homóloga.

  1. Para plásmidos multigénicos, ensambla primero un vector intermedio.
    1. Para ensamblar vectores intermedios replicativos (Figura 4A), ensamblar las siguientes seis partes: el conector izquierdo (ConLS'-pYTK008), la deserción sfGFP (pYTK047), el conector derecho (ConRE'-pYTK072), un marcador de selección de levadura, un origen de levadura de replicación, y la parte plásmida con mRFP1, un origen E. coli de replicación, y el gen resistente a la kanamicina (pYTK084).
      1. Para el ensamblaje, siga los pasos del 3.1.1 al 3.1.3.
      2. Transforme toda la mezcla de reacción de clonación en dh5α o células competentes equivalentes de E. coli, y placa en LB más 50 μg/mL kanamycina (Km). Incubar a 37 °C durante la noche.
      3. Para la proyección a base de color rojo/verde, siga el paso 3.1.5.
      4. Para la detección de desventuras, rayas y hacer crecer las colonias verdes en una placa LB + Km. A continuación, siga el paso 3.1.6.
    2. Para vectores multigénicos integradores(Figura 4B),determine primero el locus genómico de interés, luego diseñe aproximadamente 500 pares base de brazos de homología de 5' y 3' para integrarse a ese locus.
      1. Clonar los brazos homológicos de 5' y 3' del ADN genómico de levadura en el vector de entrada-pYTK001. Siga los pasos 1 y 2.
      2. Monte los siguientes siete plásmidos: el conector izquierdo (ConLS'-pYTK008), la deserción sfGFP (pYTK047), el conector derecho (ConRE'-pYTK072), un marcador de selección de levadura, el brazo homológico de 3', la parte plásmida con mRFP1, el origen E. coli de la replicación y el gen resistente a la kanamicina (pYTK090) y el brazo de homología de 5'.
      3. Para el montaje y la proyección, siga el paso 4.1.1.
  2. Montaje del plásmido multigénico
    1. Purifique los plásmidos del vector intermedio obtenido en el paso 4.1 y los plásmidos de casete del paso 3. Registre sus concentraciones utilizando un espectrofotómetro UV-Vis o un ensayo basado en fluorescencia. Diluir cada uno en ddH2O para que 1 μL tenga 20 fmol de ADN.
    2. Añadir 1 μL de vector intermedio, 1 μL de cada unidad de transcripción, 1 μL de tampón de ligasa T4 de 10x, 0,5 μL de Esp3I y 0,5 μL de ligasa T4. Lleve el volumen a 10 μL del uso de ddH2O.
    3. Para configurar la reacción de clonación, siga el paso 2.2.
    4. Transforme toda la mezcla de reacción de clonación en células competentes dh5α o equivalentes de E. coli, y placa en LB + Km. Incubar a 37 °C durante la noche.
    5. Realice la proyección verde/blanca como en el paso 3.2.5.
    6. Purifique los plásmidos de unas pocas colonias blancas y realice digestións de restricción. Se recomienda utilizar la enzima NotI-HF porque hay dos sitios NotI en la parte del origen E. coli y del marcador de selección Km, respectivamente (Figura 4B). Si el plásmido ensamblado es muy grande, entonces se puede elegir otro sitio de restricción para su posterior confirmación. Alternativamente, pantalla con pcr de colonia antes de proceder a la digestión de restricción.

5. Aplicación de plásmidos multi genes para la expresión génica cromosómica o plásmida

  1. Integración de plásmidos multigénicos en el genoma de la levadura para la expresión génica cromosómica (Figura 5)
    1. Diseñe un ARN guía (gRNA) para el locus deseado. Se recomienda utilizar varios recursos en línea, como Benchling, CRISPRdirect43y CHOPCHOP44,para determinar la especificidad máxima en el objetivo.
    2. Clonar el GRNA sintetizado de 20 nt en el plásmido pCAS45 por clonación Gibson. Linealizar el plásmido pCAS por PCR utilizando una unión de primer par invertido a la 3' de la ribozyme HDV y el 5' del tracrRNA respectivamente (Figura 5). Alternativamente, clonar el gRNA en el plásmido de deserción de sgRNA (pYTK050) y ensamblar el plásmido de deserción en un plásmido de cassette con enlazadores. A continuación, ensamblar el Cas9 TU con el plásmido de la parte Cas9 (pYTK036). Por último, ensambla el Cas9 TU y el SgRNA TU en un plásmido multigénico replicativo.
    3. Linealizar 5-15 μg de plásmido multigénico integrador con 1 μL de enzima NotI-HF durante la noche. Transforme 1 μg de pCAS-gRNA y el plásmido multigéneo integrador linealizado en S. cerevisiae. Preparar células competentes utilizando un kit de transformación de levadura disponible comercialmente o siguiendo el protocolo de Geitz y Schiestl, 200746.
      NOTA: No es necesario purificar el plásmido multigénico linealizado después de la digestión noti.
    4. Peletizar las células después de la recuperación, desechar el sobrenadante, lavar con un volumen igual de agua. Coloque las células de levadura en la placa de deserción completa del medio sintético (CSM) o en la placa del medio de dextrosa peptona de extracto de levadura (YPD) con antibióticos, dependiendo del marcador selectivo de levadura. Incubar a 37 °C durante dos días para que se formen colonias. En caso de que no se observe ninguna colonia, incubar durante uno o dos días adicionales a 30°C.
    5. Examine las colonias de levadura para su integración por la colonia PCR47.
    6. Para curar el pCAS, desenvuelve la colonia con la correcta integración en una placa YPD no selectiva. Crecer a 30 °C durante la noche. Raya una colonia desde la placa YPD hasta una placa YPD fresca. De nuevo, crecer a 30 °C durante la noche. Raya una colonia desde la segunda placa YPD hasta una YPD más 100 μg/mL nourseothricin, el marcador de selección de pCAS. El curado exitoso ocurre cuando las células de levadura no crecen en la placa selectiva.
      NOTA: Si el plásmido pCAS no se cura en dos rondas de YPD no selectivo, vuelva a rayar en un YPD fresco para otras rondas de 1-2.
  2. Transformación del plásmido multigénico replicativo para la expresión génica basada en plásmidos
    1. Transforme 100 ng-1 μg de plásmido multigéneo puro en células competentes de S. cerevisiae.
    2. Coloque las células de levadura inmediatamente después de la transformación en la placa de deserción CSM o YPD más placa antibiótica, dependiendo del marcador de selección de levadura utilizado. Incubar a 30°C durante 2-3 días para que se formen colonias.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí los resultados de cuatro plásmidos multigéneros replicativos para la producción de β caroteno (amarillo) y licopeno (rojo). Se construyó un plásmido multigénico integrador para interrumpir el locus ADE2, las colonias de las cuales son rojas.

Clonación de CDS en el vector de entrada (pYTK001)
ERG20 se amplió desde el genoma de la levadura y los tres genes carotenoides crtE, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El kit de clonación basado en MoClo desarrollado por Lee et al. proporciona un excelente recurso para el montaje rápido de una a cinco unidades de transcripción en un plásmido multigéneros, ya sea para replicación o integración en el genoma de la levadura. El uso de este kit elimina el cuello de botella de clonación que consume mucho tiempo y que con frecuencia existe para expresar múltiples genes en levadura.

Probamos cinco condiciones diferentes para los ciclos de digestión/ligadura de la cl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por la Research Foundation para la Universidad Estatal de Nueva York (Premio #: 71272) y el Premio IMPACT de la Universidad en Buffalo (Premio #: 000077).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5 mm Perlas de vidrioRPI research products9831Para lisar células de levadura
Bacto AgarBD & Empresa214010Componente de la levadura medio sintético completo (CSM)
Bacto PeptoneBD& Empresa211677Componente del extracto de levadura medio de peptona dextrosa (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733S, una versión altamente eficiente de la enzima de restricción BsaI
CarbenicillinaFisher Bioreagents4800-94-6Antibiótico para el cribado a nivel de la unidad de transcripción
CloranfenicolFisher Bioreagents56-75-7Antibiótico para el cribado en el nivel de vector de entrada
CSM-HisSunrise Sciences1006-010Suplemento de aminoácidos de la levadura medio sintético completo (CSM)
DextrosaFisher ChemicalD16-500Fuente de carbono de la levadura medio sintético completo (CSM)
Difco Levadura Base de nitrógeno sin aminoácidosBD & Empresa291940Fuente de nitrógeno de la levadura medio sintético completo (CSM)
dNTP mixPromegaU1515dNTPs para PCR
Esp3INew England BiolabsR0734Sun isoesquizomero altamente eficiente de BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II KitZymo ResearchT2001Para la transformación
levaduras HexanesFisher ChemicalH302-1Para la extracción de carotenoides de células de levadura
KanamicinaBioreactivos Fisher25389-94-0Antibiótico para el cribado a nivel de plásmidos multigénicos
LB Agar, MillerFisher BioreagentsBP1425-2 Medio deagar lisogénico para E. coli
LB Broth, MillerFisher BioreagentsBP1426-2Medio líquido lisogénico para E. coli
cultivo de licopenoquímicos de las Islas CaimánNC1142173Para la cuantificación de licopeno
MoClo YTKAddgene1000000061Laboratorio de depósito: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LPara la purificación de plásmidos de E.coli
Nanodrop EspectrofotómetroThermo ScientificND2000cPara medir concentraciones precisas de ADN
NotI-HFNew England BiolabsR3189SEnzima de restricción para la linealización integrativa de plásmidos multigénicos
Sulfato de nurseotricinaGoldbioN-500-100Marcador de selección de antibióticos para el plásmido pCAS utilizado en este estudio
Tampón de reacción Phusion HF (5X)Tampón B0518SNew England Biolabspara PCR con polimerasa Phusion
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidadNew England BiolabsM0530SPolimerasa de alta fidelidad para todas las reacciones de PCR
pLM494Addgene100539plásmido utilizado para amplificar crtI, crtYB y crtE utilizado en este estudio
Cubeta de cuarzoThermo Electron10050801Para cuantificar carotenoides
T4 ligasaNew England BiolabsM0202SLigasa para dorado Clonación de puerta
TermocicladorBIO-RAD1851148Para realizar todas las reacciones de PCR y clonación
Homogeneizadorde tejidos Bullet BlenderModelo: BBX24Para la homogeneización de células de levadura
Espectrofotómetro UV-VisThermo ScientificGenesys 150Para la cuantificación de carotenoides
Extracto de levaduraFisher BioreagentsBP1422-500Componente del extracto de levadura medio peptona dextrosa (YPD)
β-carotenoAlfa Aesar AAH6010603Para la cuantificación de β-caroteno
de cultivo Productos de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  2. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553(2009).
  3. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5(2008).
  4. Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
  5. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622(2011).
  6. Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
  7. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892(2018).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  10. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55(2007).
  11. de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16(2009).
  13. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  14. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  15. Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185(2018).
  16. Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
  17. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
  18. Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
  19. Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
  20. Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123(2017).
  21. Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
  22. Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
  23. Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
  24. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  25. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
  26. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  29. Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
  30. Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131(2019).
  31. Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965(2018).
  32. Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202(2017).
  33. Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
  34. Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
  35. Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
  36. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  37. Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
  38. Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932(2019).
  39. Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
  40. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91(2008).
  41. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  42. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
  43. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  44. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
  45. Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
  46. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  47. Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
  48. Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931(2018).
  49. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  50. Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181(1982).
  51. Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
  52. Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Golden Gate CloningModular CloningMulti Gene AssemblyYeast MoClo KitType IIS EnzymesEntry Vector CloningTranscription Unit AssemblyFluorescent Protein ScreeningDH5 Alpha TransformationUV Transilluminator Screening

Related Articles