Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

Los metabolitos, los productos intermedios o finales del metabolismo, incluidos los nucleótidos, los aminoácidos o ácidos orgánicos, los lípidos, son componentes clave para las funciones y procesos biológicos. La metabolómica, el estudio de los metabolitos, permite la exploración de sus interacciones bioquímicas y la comprensión de sus funciones en el contexto de la investigación básica, traslacional y clínica. Los metabolitos están fuertemente asociados con los fenotipos de los organismos y proporcionan información sobre las actividades bioquímicas que ocurren durante el metabolismo celular¹. Por lo tanto, además de la genómica y la proteómica, la metabolómica se ha convertido en una herramienta importante para comprender las condiciones fisiológicas y patológicas. Por ejemplo, la metabolómica se utiliza para dilucidar los mecanismos detrás de los medicamentos existentes, así como su tolerancia. En el desarrollo de fármacos, el metabolismo xenobiótico es útil para evaluar la actividad o toxicidad de los metabolitos entre especies, lo que luego se traduce en apoyar la medicina personalizada². A pesar de la amplia aplicación de la metabolómica, la obtención de imágenes de metabolitos puede ser un desafío debido a la reactividad química de los metabolitos, la heterogeneidad estructural y el amplio rango de concentración³. Sin embargo, las concentraciones de metabolitos lábiles, incluidos compuestos de alta energía, glucosa, lactato, glicolítico, vía de derivación de pentosa e intermedios del ciclo TCA, fosfolípidos, neurotransmisores, compuestos de señalización, pueden cambiar en cuestión de segundos y progresar durante minutos cuando las enzimas tisulares están activas durante los procedimientos de recolección de tejidos, como la isquemia postmortem en la recolección cerebral^4,5,6 . Para garantizar una adquisición precisa de datos metabolómicos, la preparación adecuada y cuidadosa de la muestra es crítica^7,8. Las plataformas establecidas actualmente para medir metabolitos incluyen RMN, ensayos enzimáticos y espectrometría de masas (incluida la cromatografía líquida y de gases), la última de las cuales se analiza más adelante.

MALDI-MSI es una técnica de vanguardia que permite el análisis de muestras complejas a través de la detección de especies moleculares individuales. MALDI MSI otorga el beneficio de poder medir rápida y reproduciblemente varios compuestos moleculares en muestras biológicas. Las imágenes de espectrometría de masas permiten además la producción de imágenes que representan la biología tisular basada en sus metabolitos compuestos, y lo hacen preservando la distribución espacial de los metabolitos en la muestra⁹. La capacidad de MALDI para detectar analitos en una muestra sin el uso de etiquetas de anticuerpos, modificaciones estructurales u otros reactivos especializados, como los utilizados en inmunotinción, junto con su capacidad para monitorear cientos de moléculas dentro de un solo experimento comprenden solo algunas de las ventajas que otorga la imagen de EM cuando se trata de perfiles metabólicos^{10, 11}. Además de la matriz de uso común como el ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y la 9-aminoacridina (9-AA), recientemente se descubrió una nueva matriz N -(1-Naftil) etilendiamina diclorhidrato (NEDC), que es muy adecuada para el análisis de varios metabolitos de bajo peso molecular, ha mejorado aún más la aplicación de MALDI MSI en el perfil metabólico¹².

A pesar de la amplia aplicación de MALDI MSI, el alto costo del instrumento y la complejidad del procedimiento experimental impiden su implementación más amplia en laboratorios de investigación individuales. Por lo tanto, la mayoría de los estudios MALDI MSI son apoyados a través de instalaciones básicas compartidas. La preparación de la muestra, incluida la preparación de diapositivas y el recubrimiento de la matriz, es el paso más crítico en MALDI MSI. Sin embargo, la preparación de la diapositiva se lleva a cabo normalmente en el laboratorio del investigador individual, lo que crea variaciones potenciales en la adquisición posterior de MALDI MSI. Aquí nuestro objetivo es proporcionar un protocolo detallado para la preparación de muestras biológicas antes de proceder a las mediciones de MALDI MSI, y utilizar un perfil metabolómico del cerebro de ratón en desarrollo como ejemplo.

El protocolo sigue las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Investigación científica avanzada (ASRC) de la Universidad de la Ciudad de Nueva York (CUNY).

1. Cosecha el tejido

1. Prepara el bote de aluminio. Prepara un rectángulo de aluminio de 10cm x 20 cm, dobla en el medio para hacer cuadrados de doble capa de 10 cm. Etiquete la información de la muestra en un lado y doble el otro lado para formar un bote con una superficie inferior de aproximadamente 4 cm x 4 cm.
2. Preenfóque el barco en el nitrógeno líquido (LN₂₎en una caja de espuma de poliestireno.
   NOTA: Si el bote es demasiado pequeño, la muestra puede caerse del bote y congelarse al contactar directamente con LN_2,lo que puede resultar en fragmentación durante la crioseccionamiento.
3. La eutanasia del animal por luxación cervical siguiendo las pautas institucionales de la IACUC, disecciona inmediatamente el tejido de interés.
   1. Mantenga el intervalo entre la anestesia animal y la congelación instantánea lo más corto posible, para minimizar la alteración de los metabolitos durante la recolección de tejidos, especialmente los metabolitos labiales en el cerebro debido a la isquemia postmortem.
      NOTA: La perfusión del animal con solución salina tamponada con fosfato (PBS) aumentará la duración de la isquemia, alterando aún más las concentraciones de metabolitos lábiles y exagerando los resultados artificiosos. Por lo tanto, no se recomienda la perfusión o el lavado del tejido con PBS, a menos que la contaminación de la sangre o el fluido corporal sea más preocupante que el deterioro o lavado de metabolitos para el proyecto individual.
4. Coloque inmediatamente el tejido en el bote de aluminio que flota en nitrógeno líquido, cierre la tapa de la caja de espuma de poliestireno y congele durante 2-10 minutos dependiendo del tamaño del tejido: 2 min, 5 min, 7 min para el día postnatal 1 (P1), P21, P60 cerebro de ratón, respectivamente, y 10 min para cerebro de rata P60.
   NOTA: No congele el tejido durante un tiempo prolongado (por ejemplo, 5 minutos para el cerebro de ratón P1) ya que el sobrecongelado podría provocar la fragmentación del tejido durante la crioseccionación.
5. Retire el bote con fuerceps, doble la lámina para envolver el tejido, transporte sobre hielo seco y guárdelo a -80 °C para su uso posterior. Si le sigue una seccionamiento inmediato, lleve las muestras sobre hielo seco hasta el criostato.
   NOTA: Para preservar mejor los metabolitos, se prefiere almacenar la muestra en tejido intacto y seccionarla justo antes de proceder a la imagen MALDI. El tejido se puede almacenar en -80 °C durante un plazo de hasta 24 meses.

2. Criosectación del tejido

NOTA: Use guantes en todo momento cuando manipule los portaobjetos de tinóxido de indio (ITO). Evite la respiración directa en el portaobjetos o use máscaras (opcional) para evitar la contaminación de la saliva humana en la sección de tejido.

1. Antes de seccionar el tejido, reúna el número deseado de portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO compatibles con MALDI.
2. Pruebe la conductividad de la corredera con un voltímetro ajustado a la resistencia. Etiquete el lado donde se lee una medición de resistencia: este será el lado al que se adhieren las secciones de tejido. Siempre coloque el tobogán sobre una toalla de papel limpia para evitar la contaminación.
3. Enfríe previamente las diapositivas en un criostato ajustado a -20 °C.
4. Si se extrajeron muestras de tejido de los -80 °C, deje que el tejido se equilibre en la cámara de criostato durante unos 45-60 minutos, dependiendo del tamaño del tejido. Si las muestras se están retirando del hielo seco, equilibre durante unos 30 minutos.
5. Limpie a fondo el criostato con etanol al 70%. Enfríe previamente todas las herramientas necesarias, incluido el pincel de artista de punta delgada y las forrcepciones en la cámara del criostato.
6. Ajuste la temperatura de la cámara criostato y la cabeza de la muestra según el tipo de tejido: -14 ° C para el hígado, -20 ° C para el músculo y -25 ° C para la piel⁹.
7. Monte el tejido en el mandril utilizando el tejido criostático que incrusta el compuesto OCT, evitando la OCT de la región de interés.
8. Coloque una cuchilla limpia en el escenario y bloquee. Ajuste la posición del escenario y el ángulo de la muestra para lograr el ángulo de corte deseado.
   NOTA: Si se van a cortar diferentes tipos/genotipos de tejido, asegúrese de reposicionar la muestra para que se use una parte limpia de la cuchilla o cambiar a una cuchilla nueva antes de cortar la siguiente muestra para evitar la contaminación cruzada.
9. Continúe cortando hasta que se encuentre la región de interés (por ejemplo, el cuerpo calloso en el cerebro). Asegúrese de mantener el escenario limpio cepillando las piezas adicionales con un pincel de artista que se haya equilibrado en el criostato.
10. Una vez que se revela la región deseada, corte secciones más pequeñas de 10-12 μm de espesor. Si la sección tiende a desprenderse o desmoronarse fácilmente, eleve la temperatura del criostato, manteniéndose en el rango de -22 °C a -11 °C. Hemos encontrado que la temperatura de corte óptima para el tejido cerebral es de -15 ° C a - 18 ° C.
11. Una vez cortada una buena sección, adherirla a la diapositiva ITO (operar en la cámara criostato).
12. Transfiera una sección del tejido a las diapositivas ITO usando la punta del pincel artista.
13. Caliente la sección con los dedos colocando un dedo debajo de la corredera para calentar la sección y garantizar un montaje seguro. La sección de tejido primero se volverá transparente en 5-10 s y luego se volverá opaca en aproximadamente 30-60 s.
14. Aparta cuidadosamente la diapositiva en el criostato.
15. Repita los pasos para otras muestras de tejido, asegurándose de que cada sección del tejido se coloque uniformemente en el portaobjetos y esté lo más alineada posible.
16. Dado que el objetivo MALDI puede contener hasta dos diapositivas, coloque las secciones de varias muestras de la misma cohorte en una sola diapositiva o en dos diapositivas, para garantizar que se puedan analizar al mismo tiempo.
17. Cuando termine, coloque las diapositivas ITO en una caja de vacío y transfiéralos a un desecador con desecante. Seque al vacío el portaobjetos durante 45-60 min.
    NOTA: Si un desecador de vacío no está disponible en el laboratorio, mantenga las diapositivas por debajo de -20 ° C todo el tiempo para evitar el deterioro de los metabolitos.
18. Almacenamiento y envío de diapositivas: a menos que la muestra sea preparada por las instalaciones centrales de imágenes maldi para proceder directamente a las imágenes MALDI, almacenar las diapositivas a -80 ° C o enviar a las instalaciones centrales u otros laboratorios de investigación MALDI en hielo seco.
19. Para preservar mejor las muestras, coloque las diapositivas en el transportador de diapositivas, llénelo con nitrógeno (opcional), selle con parafilm, colóquelo en una bolsa con cremallera, que luego se coloca en otra bolsa con cremallera que contenga desecante. Etiquete la bolsa exterior con cremallera.
20. Proceda al almacenamiento a -80 ° C (hasta 6 meses) o al envío con hielo seco adecuado.

3. Preparación de la matriz

1. Preparar la matriz.
   NOTA: Todos los reactivos deben ser de grado HPLC.
   1. Preparar NEDC a una concentración de 10 mg/ml. Preparar 10 mL de matriz disuelta en un disolvente de metanol al 70% (100 mg de NEDC, 7 mL de metanol, 3 mL de H₂O).
   2. Además, prepare 10 ml adicionales de solución de metanol: agua al 70% para enjuagar el sistema de pulverización antes de rellenar la matriz.
2. Una vez que las diapositivas estén deshidratadas en el paso 2.17, coloque las marcas "X" en el espacio en blanco de la diapositiva de vidrio fuera de las secciones de tejido usando un marcador plateado de punto en negrita, y luego coloque una segunda "x" con un marcador negro de punto fino en la parte superior de la "X" plateada. La "X" negra con un fuerte contraste fuera del fondo plateado (la negrita plateada "X") servirá más tarde como marcador fiduciario para la posterior adquisición de espectros de masas en el instrumento MALDI.
3. Cargue la diapositiva en el objetivo metálico de la diapositiva MALDI. Use una cubierta de plástico y dibuje / delinee donde las muestras están en la cubierta de plástico. Reservar.
4. Escanee la imagen de la diapositiva junto con el objetivo MALDI utilizando un escáner plano. Los tornillos en la superficie del objetivo servirán como espaciador para evitar el daño o la contaminación de la sección de tejido por parte del escáner. Obtenga una vista previa y escanee el área de diapositiva seleccionada en escala de grises de 16 bits y 2400 ppp. Guarde la imagen para su uso posterior en MALDI MSI.

4. Deposición matricial

NOTA: Existen múltiples métodos para aplicar una capa uniforme de matriz en tamaño de cristal fino en la diapositiva MALDI, incluida la sublimación, la impresión de inyección de tinta de gotas, el pulverizador automático de matriz y el pulverizador manual utilizando artist airbush⁹. Utilizaremos el pulverizador automático de matriz como ejemplo en este protocolo por su alta reproducibilidad.

1. Arranque: Encienda la unidad de pulverización matricial, asegurándose de que la válvula esté colocada en LOAD y lance el software de pulverización. Compruebe que el ventilador de escape funciona bien. No encienda la bomba de disolvente si la ventilación activa no funciona correctamente.
2. Confirme en la pestaña Comunicaciones que todo se está comunicando y luego inicie la bomba de solvente a .1 mL / min, con una contrapresión de ~ 500 psi (o 3.4 MPa).
3. Inicie el flujo de aire comprimido al pulverizador de matriz configurando el tanque de nitrógeno a 30 psi. Luego, ajuste el regulador de presión en la parte frontal del pulverizador a 10 psi y ajuste la temperatura de la boquilla del pulverizador como desee.
   NOTA: Si la presión del aire en la oración es inferior a 5 psi, la boquilla del pulverizador no podrá calentarse para protegerse.
4. Con la válvula todavía en la posición LOAD, use una jeringa para enjuagar el bucle con 7 ml de metanol al 70% y luego llene el bucle con 6 ml de matriz.
5. Coloque los deslizamientos de tejido en los soportes en el pulverizador, pegando con cinta adhesiva ambos extremos para evitar el movimiento y preservar un borde libre de matriz para evitar la contaminación de la abrazadera de metal en el objetivo MALDI por la matriz.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente probar el spray de matriz en un portaobjetos de microscopio en blanco antes de proceder a las preciosas diapositivas de muestra.
6. Verifique que el caudal y la temperatura sean estables para comenzar la pulverización.
7. Seleccione el método deseado previamente probado con una diapositiva de vidrio en blanco.
8. Pulse Inicio. Esto establecerá la temperatura de la boquilla y ajustará el caudal de la bomba para que coincida con el método seleccionado. Cambie la válvula de la posición de carga a pulverización y luego confirme haciendo clic en Continuar.
9. Permita que el sistema se ejecute, lo que tomará de 5 a 20 minutos por diapositiva dependiendo del método. Cambie la válvula de la posición De pulverización a Carga y luego confirme haciendo clic en Continuar cuando haya terminado.
10. Retire la(s) diapositiva(s) del pulverizador, examine el patrón de recubrimiento de la matriz bajo el microscopio para asegurar una capa uniforme de cristal de matriz fina.
11. Después de la deposición de la matriz, coloque la(s) diapositiva(s) en el soporte de metal MALDI para su uso inmediato. Si solo hay una diapositiva de muestra, agregue otra diapositiva en blanco para llenar los dos espacios del soporte MALDI.
12. Limpie el sistema inmediatamente después del uso siguiendo las instrucciones del fabricante, para evitar la obstrucción de la boquilla del pulverizador.
13. Después de recubrir el portaobjetos de muestra con matriz, proceda inmediatamente al instrumento de imágenes MALDI o envíelo con hielo seco utilizando la misma preparación de bolsa de doble cremallera descrita en el paso 2.19.
    NOTA: En circunstancias de emergencia, como que el instrumento MALDI no está disponible para su uso inmediato, guarde la corredera recubierta en condiciones de vacío o a -20 ° C durante un período de hasta 24 horas, aunque el deterioro de algunos metabolitos puede ocurrir durante el almacenamiento, que no se ha estudiado a fondo.

El experimento representativo se realizó de acuerdo con el flujo de trabajo que se muestra en la Figura 1. Los cerebros de ratón de tipo salvaje C57BL en desarrollo de los días postnatal 1, 21, 60 (adultos) se cosecharon como se describió anteriormente siguiendo las pautas de CUNY IACUC y se congelaron durante 2, 5 y 7 minutos, respectivamente, en un bote de aluminio flotando sobre nitrógeno líquido. Los tejidos congelados se crioseccionaron a secciones de 10 μm de espesor a -15 °C establecidas tanto para la cabeza de la muestra como para la cámara. Las criosecciones de tejido se transfirieron suavemente al lado conductor preenfriado de los portaobjetos de vidrio recubiertos de ITO para imágenes MALDI. Las criosecciones montadas en portaobjetos ITO se desecaron al vacío durante 45 minutos a temperatura ambiente, seguidas de la deposición de la matriz utilizando un pulverizador de matriz automático. Se utilizó la matriz NEDC para detectar metabolitos, y se depositó una solución matricial de 10 mg/mL en metanol/agua (70/30, v/v) a un caudal de 0,1 mL/min y a una temperatura de boquilla de 75 °C durante 12 ciclos con 5 s de secado entre cada ciclo. Se utilizó una velocidad de pulverización de 1300 mm/min, espaciado de vías de 2 mm, presión de gasN 2 de 10 psi y caudal de 3 L/min y altura de boquilla de 40 mm.

Los espectros de masas MALDI fueron adquiridos en modo de iones negativos por el instrumento MALDI time of flight (TOF) MSI. 0.5-1 μL de fósforo rojo (grupos de Pn con n = 1 - 90) emulsión en metanol se depositó en las diapositivas ITO, junto a los tejidos montados, y se utilizó para calibrar el instrumento en el rango de masa de 100 - 1000 m / z mediante la aplicación de la curva de calibración cuadrática13. Los diámetros de los puntos láser se enfocaron al perfil de haz modulado "Medio" para un ancho ráster de 50 μm. Los espectros dentro del rango de masa de m/z 50 a 1000 fueron adquiridos a 1000 Hz para 500 disparos. Se registraron los datos de espectros de masas y las imágenes se analizaron más a fondo utilizando el software avanzado de análisis de datos MALDI MSI. Las imágenes de iones se generaron con normalización de cuadrado medio de raíz (RMS) a un ancho de contenedor de ±0,25 Da.

Los resultados de la Figura 2 muestran imágenes de salida del software de análisis de datos MALDI MSI de espectros m/z seleccionados de cada intervalo de 100 Dalton, representando claramente la utilidad para la identificación de espectros desde metabolitos de moléculas pequeñas hasta lípidos de alto peso molecular. Cada fila representa los respectivos mapas de calor iónico que contienen información espacial y espectral de una determinada especie de metabolitos en tres tejidos recolectados en los días postnatales 1, 21 y 60. Para cada m/z representativo, se puede utilizar el análisis de la distribución regional y las abundancias de iones para comparar cantidades relativas de especies correspondientes entre diferentes edades. Una fortaleza de la metodología MALDI MSI es la capacidad de discernir la especificidad de ciertas especies identificadas por m / z a hitos de desarrollo o estructuras anatómicas específicas. Se observa que algunos metabolitos están enriquecidos en neonatos P1 (m/z 320,1), enriquecidos en adultos P60 (m/z 846,5) o distribuidos uniformemente entre edades (m/z 480,3); otras especies moleculares están específicamente enriquecidas en materia gris (m/z 117.1; 524.3; 765.1), materia blanca (m/z 673.4; 846.5) o CSF/ventrículos (m/z 239.0) (Figura 2A). También se muestra la distribución espacial de metabolitos representativos que incluyen hipoxantina (m/z 135.0), ácido N-acetil-L-aspártico (m/z 174.0), ácido araquidónico (m/z 303.2) y varios lípidos como lisofosfatidiletanolamina LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfatidiletanolamina PE (44:10) (m/z 838,5), fosfatidilinositol PI(38:4) (m/z 885,6) (Figura 2B).

Figura 1. Flujo de trabajo de imágenes de espectrometría de masas maldi-tiempo de vuelo (TOF). El tejido congelado a presión se crirosecciona en criostato y se monta en la diapositiva ITO. → El portaobjetos con secciones de tejido está recubierto con una fina capa de matriz utilizando pulverizador automático de matriz. → espectros de masas es recogido por el instrumento MALDI-TOF MSI a una ráster de 20-200um. → Los datos se analizan y las imágenes se generan utilizando el avanzado software de análisis de datos MALDI MSI. Barra de escala: 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Salida representativa con espectros m/z seleccionados de espectrometría de masas adquirida a una resolución lateral de 50 μm. (A) Un mapa de calor representa la distribución espacial de especies de metabolitos específicos seleccionados de cada intervalo de 100 Dalton m/z a través de los tres hitos de desarrollo identificados en P1, P21 y P60. (B) La distribución espacial de metabolitos representativos en P1, P21 y P60, incluyendo: hipoxantina, ácido N-acetil-L-aspártico, ácido araquidónico, y diferentes especies de lípidos como lisofosfatidiletanolamina (LPE), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI). Barra de escala, 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.