Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos

Resumen

Se describe un protocolo para reprogramar fibroblastos derivados de la piel humana en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs), y su posterior diferenciación en astrocitos inducidos (iAs). Este método conduce a la generación rápida y reproducible de iNPCs e iAs en grandes cantidades.

Resumen

La investigación sobre los trastornos neurológicos se centra principalmente en el impacto de las neuronas en los mecanismos de la enfermedad. La disponibilidad limitada de modelos animales afecta gravemente el estudio de las contribuciones específicas del tipo celular a la enfermedad. Por otra parte, los modelos animales no reflejan generalmente variabilidad en mutaciones y cursos de la enfermedad considerados en pacientes humanos. Los métodos de reprogramación para la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) han revolucionado la investigación específica del paciente y han creado herramientas valiosas para estudiar los mecanismos de la enfermedad. Sin embargo, la tecnología iPSC tiene desventajas como el tiempo, el compromiso laboral, la selectividad clonal y la pérdida de marcadores epigenéticos. Las modificaciones recientes de estos métodos permiten una generación más directa de linajes celulares o tipos específicos de células, evitando el aislamiento clonal o un estado de células madre pluripotentes. Hemos desarrollado un método de conversión directa rápida para generar células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) de fibroblastos de la piel que utilizan vectores retrovirales en combinación con medios neuralizantes. Los iNPCs se pueden diferenciar en neuronas (iNs) oligodendrocitos (iOs) y astrocitos (iAs). La producción de iAs facilita las pruebas rápidas del mecanismo de la droga y de la enfermedad pues la diferenciación de iNPCs toma solamente 5 días. Además, los iAs son fáciles de trabajar y se generan en poblaciones puras en grandes cantidades. Desarrollamos un ensayo de co-cultivo altamente reproducible utilizando neuronas GFP + de ratón e iAs derivados del paciente para evaluar posibles estrategias terapéuticas para numerosos trastornos neurológicos y neurodegenerativos. Es importante destacar que los ensayos iA son escalables al formato de 384 pozos, lo que facilita la evaluación de múltiples moléculas pequeñas en una placa. Este acercamiento permite la evaluación terapéutica simultánea de variedades de células pacientes múltiples con el fondo genético diverso. La fácil producción y almacenamiento de iAs y la capacidad de examinar múltiples compuestos en un solo ensayo hacen que esta metodología sea adaptable para la medicina personalizada.

Introducción

La comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad es crítica para las enfermedades neurológicas, ya que ayuda en el desarrollo de posibles estrategias terapéuticas. Mientras que los modelos animales han sido históricamente el patrón oro para la investigación de enfermedades del sistema nervioso, la traducción directa de terapias potenciales en un entorno clínico a menudo muestra un éxito limitado^1,2,3. Las razones de la falta de traducción son la falta de variabilidad de los antecedentes genéticos y las mutaciones en ratones, la visualización incompleta de fenotipos de enfermedades y la variación en la sensibilidad o la dosificación de fármacos en pacientes humanos que no se muestran bien en cepas de ratón consanguíneo. Además, para muchos desordenes neurológicos raros, ningunos o pocos modelos animales están disponibles. El estudio de los mecanismos de la enfermedad directamente en los tipos de células humanas relevantes podría facilitar la investigación y mejorar la traducción a la clínica. Para los trastornos del SNC, las células humanas primarias son difíciles de recuperar y representan una fuente muy limitada, ya que las biopsias son invasivas o solo se pueden recuperar post mortem en la etapa final de la enfermedad. En los últimos 15 años, el desarrollo de la tecnología de reprogramación celular ha ampliado rápidamente la capacidad de modelar enfermedades neurológicas y neurodegenerativas humanas in vitro.

Los métodos tradicionales de reprogramación celular implican la reprogramación de fibroblastos u otros tipos de células en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) capaces de diferenciarse en tipos de células de las tres capas germinales⁴. Takahashi y Yamanaka fueron los primeros en demostrar que la reexpresión de cuatro factores de transcripción de células madre es suficiente para redirigir las células somáticas para convertirse en iPSCs⁵. Los iPSC se pueden entonces diferenciar más lejos en tipos específicos de la célula. Sin embargo, el inconveniente de este proceso es que requiere mucho trabajo y mucho tiempo generar y aislar clones estables de células madre. Las mutaciones somáticas o aberraciones específicas de la célula madre también se mantienen en el clon de células madre y pueden afectar los resultados del estudio^6. Además, cada vez hay más evidencia que sugiere que el proceso de reprogramación a células madre borra valiosos cambios epigenéticos que podrían influir en los mecanismos de la enfermedad celular^4,7,8. En los últimos años, los investigadores se centraron en métodos de reprogramación modificados que permiten una generación más directa de diferentes tipos de células mientras se pasa por alto el estado de las células madre pluripotentes^{9,10,11, 12} (revisado en ^13,14). Los avances iniciales revelaron la reprogramación combinatoria in vitro de fibroblastos a cardiomiocitos^15,neuronas¹⁶ y hepatocitos¹⁷ por expresión ectópica de múltiples factores de transcripción específicos del linaje o microRNAs^18. Esto fue seguido por estudios que reprogramaron directamente las células para modelar trastornos neurológicos^19,20. Como se mencionó anteriormente, tales protocolos de reprogramación o conversión directa tienen ventajas potenciales sobre los protocolos iPSC clásicos, incluida la velocidad y la ablación del paso de aislamiento clonal. Por otra parte, la evidencia sugiere que estos protocolos permiten mantener una mayor cantidad de información epigenética relacionada con la edad del paciente y probablemente lo mismo ocurre con los marcadores relevantes de la enfermedad^7,8.

Hasta la fecha, la mayoría de las investigaciones in vitro sobre trastornos neurológicos se han centrado principalmente en las neuronas. Sin embargo, es bien sabido que otros tipos de células como los astrocitos, la microglía y los oligodendrocitos juegan un papel crítico en la patología de la enfermedad y la progresión de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington (EH), la esclerosis múltiple (EM) y otras patologías neurológicas como el síndrome de Rett (RTT), trastornos del sueño, adicción, epilepsia, trastornos de almacenamiento lisosomal, depresión, migraña y dolor patológico^{21,22,23,24,25,26.} Los astrocitos son el tipo celular más abundante en el sistema nervioso central (SNC) y hasta hace poco, han sido ampliamente descuidados desde un punto de vista patológico⁷. Ahora se saben para tener un papel crítico en la apoyación de casi todas las funciones homeostáticas del CNS sano. Adicionalmente, es evidente que tienen un impacto patológico importante y son muy valiosos para comprender el mecanismo de la enfermedad y evaluar las estrategias terapéuticas¹⁹.

En la descripción actual, detallamos un protocolo para la conversión directa de fibroblastos pacientes humanos en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) utilizando vectores retrovirales que expresan los factores de reprogramación de Yamanaka (Klf4, Oct3/4, Sox2 y c-Myc) y la posterior exposición a medios neuralizantes. Estudios anteriores han utilizado diferentes combinaciones de factores transcripcionales para la reprogramación directa a las células neuronales (revisado en ¹⁴), pero los factores utilizados en el protocolo descrito están ampliamente disponibles, ya sea como plásmidos para la producción interna de vectores virales, o como disponibles comercialmente listos para ir kits de reprogramación viral. Los iNPCs resultantes se pueden diferenciar aún más en neuronas inducidas (iNs)^27,oligodendrocitos (iOs)²⁴ y astrocitos (iAS)¹⁹ para estudiar su papel en enfermedades neurológicas. Nuestro protocolo no implica la generación lenta de iPSCs que la mayoría de los protocolos disponibles utilizan para la derivación de astrocitos humanos²⁸. Aproximadamente del 98% al 100% de los iNPCs reprogramados directamente pueden diferenciarse en astrocitos positivos para GFAP²⁹ en comparación con solo el 2% utilizando el método de conversión directa de fibroblastos a astrocitos^30. Recientemente, un estudio transcriptómico comparativo utilizando nuestro método de reprogramación descrito ha demostrado que los iNPCs reprogramados a partir de fibroblastos donantes pueden retener características de envejecimiento a nivel transcripcional y funcional similares a los astrocitos post mortem de edad comparable y los astrocitos primarios²⁹. Así, este protocolo de la conversión es una herramienta potente para investigar mecanismos de la enfermedad y para evaluar los acercamientos terapéuticos nuevos para los desordenes neurodegenerative y neurológicos relativos a la edad.

Aquí describimos el protocolo utilizado para generar iNPCs y una mayor diferenciación en iAs, que son los más adecuados para ensayos de cribado molecular pequeños a mayor escala. Los mecanismos de la enfermedad y las pruebas de fármacos con iAs se pueden realizar utilizando diferentes metodologías como los co-cultivos con neuronas o el análisis metabólico y bioquímico. La ventaja de este sistema es la velocidad y facilidad de mantenimiento de estas líneas celulares en comparación con las iPSC. Además, los iNPCs se pueden congelar en pequeñas porciones para la diferenciación de iAs, lo que facilita las pruebas de drogas en condiciones constantes durante períodos prolongados de tiempo. En general, la comparación de números de muestra más grandes se hace posible de esta manera, lo que abre la puerta para evaluar el potencial terapéutico de los compuestos en una población de pacientes más grande y representativa.

Protocolo

Medio	Reactivo	Cantidad a mezclar	Concentración final (%)
Medios de fibroblastos	DMEM, glucosa alta, GlutaMAX	500 mL	89
	Suero fetal bovino	50 mL	10
	Antibiótico-Antimicótico	5 mL	1
Medios base	DMEM/F12 + Glutamax	500 mL	97
	N-2	5 mL	1
	B-27	5 mL	1
	Antibiótico-Antimicótico	5 mL	1
Medios de conversión	Medios base	50 mL	99.9
	FGF	1 μL	0,02 (20 ng/mL)
	FEAG	1 μL	0,02 (20 ng/mL)
	heparina	50 μL	0,1 (5 μg/mL)
Medios de células progenitoras neuronales (NPC)	DMEM/F12 + Glutamax	500 mL	96.9
	N-2	5 mL	1
	B-27	5 mL	1
	Antibiótico-Antimicótico	5 mL	1
	FGF	10 uL	0.002
Medios de astrocitos	DMEM, glucosa alta, GlutaMAX	500 mL	89
	Suero fetal bovino	50 mL	10
	Antibiótico-Antimicótico	5 mL	1
	N-2	1 mL	0.2
Los medios deben filtrarse después de mezclar todos los componentes. Los medios de conversión (con factores) deben prepararse frescos cada semana.

Tabla 1. Recetas de medios para todos los tipos de células incluidos en el protocolo. Los medios deben filtrarse después de mezclar todos los componentes con un sistema de filtración al vacío estéril para grandes volúmenes o jeringa y filtros de jeringa de 0,2 um. Los medios de conversión (con factores) deben prepararse frescos cada semana.

1. Conversión directa de fibroblastos humanos adultos a células progenitoras neuronales

NOTA: Una línea de tiempo esquemática de este protocolo se puede revisar en Meyer (2014)¹⁹.

1. Utilizar fibroblastos primarios de la piel humana que pueden obtenerse de bancos celulares o biopsias de piel³¹. Cultivar células a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos de CO_{2 al 5%.} Las células de paso durante al menos 1-2 pasajes después de la descongelación antes de su uso en el experimento. Una vez que las células estén listas, recubra un pozo de una placa de 6 pozos con fibronectina humana (1:200 diluida en PBS) a temperatura ambiente durante 15-20 min.
2. Cuando las células estén listas para ser plateadas, retire la fibronectina del plato y agregue inmediatamente la solución celular o 2 mL de medio fibroblasto(Tabla 1)- no deje que el plato se seque antes de agregar el medio. Dependiendo de qué tan rápido crezcan las células, placa 150,000 (crecimiento rápido) - 200,000 (crecimiento lento) fibroblastos en dos pozos de una placa de 6 pozos recubierta de fibronectina humana cada uno.
   NOTA: Las células deben estar alrededor del 70% confluyentes para la transducción viral para poder mantenerlas en la misma placa durante varios días más después de la transducción. Puede ser beneficioso sembrar en dos densidades diferentes para tener una opción al día siguiente para la conversión.
3. Al día siguiente de la siembra, compruebe los fibroblastos bajo el microscopio y verifique la densidad celular (entre el 70-85%) e incluso sembrando en todo el pozo para obtener resultados óptimos.
4. Transducir un pozo con los cuatro vectores retrovirales (Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc) - use una multiplicidad de infección (MOI) de 10 para fibroblastos de crecimiento rápido o 15 para fibroblastos de crecimiento lento (la eficiencia de transducción debe exceder el 70% o más de células positivas para cada vector). Agregue el medio de fibroblastos regular a la mezcla viral a un volumen total de 1 mL por pozo e incube durante la noche a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos al 5% de CO_2. Deje el segundo pozo sin tratar y devuelva las células a la incubadora de cultivo de tejidos.
   NOTA: Los vectores retrovirales pueden ser comprados por un proveedor o hechos internamente, los protocolos están disponibles en línea³².
5. Al día siguiente de la transducción, lave las células 1x con PBS y agregue 1 mL de medio fibroblasto fresco.
6. Al día siguiente, cambie el medio a medio de conversión. Lave las células 1x con PBS para deshacerse del medio de fibroblastos residual, y luego agregue 1 mL de medio de conversión. Cambie los medios del pozo no tratado a medios de conversión también.
   NOTA: Algunos cambios morfológicos se pueden observar incluso cambiando los medios en los fibroblastos que no recibieron tratamiento con vectores retrovirales, por lo que tener un pozo no tratado (opcional) será útil para determinar los efectos de los vectores virales. Las células deben comenzar a cambiar la morfología 2-4 días después de cambiar a medios de conversión.
7. Observar las células bajo el microscopio y observar los cambios en la morfología (Figura 1). Los medios celulares deben ser reemplazados diariamente durante todo el proceso de conversión (1-2 mL de medios de conversión, Tabla 1)y para el cultivo posterior de iNPC. Cambie el medio eliminando cuidadosamente el 70% del medio del pozo mientras se asegura de que las células permanezcan cubiertas en el 30% restante del medio.
   NOTA: Los medios con factores de crecimiento en él deben consumirse dentro de 1 semana de la preparación.
   1. Continúe observando las células y cambie los medios diariamente (1-2 mL de medios de conversión).
   2. Algunas líneas celulares comienzan a formar formaciones redondas elevadas sueltas que crecen en estructuras similares a bolas o esferas neuronales sueltas(Figuras suplementarias 1 y ^19,33). Tenga cuidado de no desprenderse de estas células. Si las bolas se desprenden, se pueden recoger y volver a platear en un nuevo pozo recubierto de fibronectina de una placa de 6 pozos.
      NOTA: Si se expanden por sí solas, las células tendrán una diversidad reducida en comparación con la placa inicial y pueden representar una línea celular claramente diferente. Se recomienda combinar estas celdas con el resto de las celdas convertidas en la siguiente ronda de división.
8. Después de unos 5-6 días en medios de conversión (hasta 12 días para líneas celulares difíciles) o cuando las células se vuelven muy densas, pasarlos 1:2 o máximo 1:3.
   NOTA: Es muy importante mantener las celdas en una alta densidad durante todo el proceso de conversión.

2. Procedimiento de conversión y división iNPC

1. Caliente la solución del desprendimiento de la célula (e.g., Accutase) y cubra un número apropiado de pozos de un 6-well con fibronectin (1:200 en PBS, 1 mL de volumen de capa) por 15-20 minutos en la temperatura ambiente. El recubrimiento de fibronectina puede ser más largo sin impacto negativo, pero se debe tener cuidado de no acortar el tiempo de recubrimiento.
2. Lave las células cuidadosamente con PBS sin desprender ninguna célula (use la pared del pozo para aplicar PBS suavemente a las células). Retire cuidadosamente el PBS con pipetas o por aspiración.
3. Añadir 0,5 mL de solución de desprendimiento celular e incubar 2-3 min a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos. Compruebe bajo el microscopio para verificar que la mayoría de las células se han desprendido. Si todas las células se han desprendido, agregue 2 mL de medios de conversión frescos y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces para disociar los grupos (si es necesario).
4. Recoja las células en un tubo de 15 mL y agregue 3 mL adicionales de medios para diluir aún más la solución de desprendimiento celular. Lave el pozo con el medio adicional primero para asegurarse de que todas las células se han recogido.
5. Centrífuga durante 4 min a 200 x g a temperatura ambiente.
   NOTA: Las células de conversión o iNPCs son extremadamente sensibles a la presencia de solución de desprendimiento de células en el medio. Es absolutamente necesario eliminar la enzima residual por centrifugación y retirada del sobrenadante.
6. Retire el sobrenadante del pellet celular y resuspend las células en 1 mL de medio fresco. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces para resolver los grupos celulares. Retire la fibronectina de los 6 pozos recubiertos y agregue 1 mL de medio fresco a cada pozo inmediatamente (no deje que la fibronectina se seque). Para una relación de división de 1:2, agregue 0.5 mL de la suspensión celular en un pozo y el otro 0.5 mL en un segundo pozo.
   1. Cultivar células a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos.
7. Distribuya las células agitando suavemente los 6 pozos en dirección norte-sur-este-oeste (no circular) y ponga en incubadora de cultivo de tejidos.
8. Observe las células bajo el microscopio al día siguiente y cambie los medios (1-2 mL). Cambie los medios todos los días hasta que las celdas estén listas para dividirse de nuevo.
   NOTA: En este punto, la proliferación celular debe comenzar a acelerarse, y las células deben estar listas para una segunda división dentro de 2-3 días (4 días para líneas de crecimiento muy lento).
   1. En esta nueva división, se siembra un pozo de células en medios de conversión y el otro pozo en medios NPC que contienen sólo FGF a mayor concentración sin EGF/heparina (Tabla 1).
      NOTA: Algunas líneas celulares alcanzan un estado estancado en los medios de conversión después de aproximadamente 10 días y cambiar a medios NPC podría ayudar con el crecimiento celular. Además, los NPCs tienen una forma más específica y más pequeña, cuando se cultivan en medios NPC¹⁹. En este punto, los iNPCs están listos para la diferenciación y el uso posterior.
9. Siga cambiando los medios (1-2 mL) de los iNPCs diariamente.
   1. Expanda los NPCs en platos de 10 cm combinando dos o tres pozos confluentes de un pozo de 6. El volumen de medios para platos de 10 cm es típicamente de 12-15 mL.
   2. En la siguiente división, expanda aún más estas células a tres o cuatro platos de 10 cm (12-15 mL de medios) para generaciones de grandes cantidades de existencias celulares. Los platos de 10 cm generalmente se dividen en 1:3 o 1:4 cada 3-4 días, dependiendo de la tasa de proliferación.

3. Generación de astrocitos inducidos a partir de NPCs

1. Para hacer astrocitos a partir de iNPCs frescos, sembrar iNPCs (en placas recubiertas de fibronectina de 10 cm) directamente en medio de astrocitos de 10 mL(Tabla 1)para que estén alrededor del 10% de confluencia al día siguiente. Cultivar células a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos de CO_{2 al 5%.}
   NOTA: La densidad de siembra recomendada suele ser de 50 μL de la resuspensión celular de un plato de NPCs de 10 cm, siempre que se diluyan a un volumen final basado en su relación de división (por ejemplo, 3 mL para una división 1:3, 4 mL para una división 1:4, etc.).
2. Cambiar el medio (10 mL de medios de astrocitos) de los iAs tres días después del revestimiento. Mantenga las células diferenciadoras durante 5-7 días.
   NOTA: Los iAs no toleran bien múltiples pasajes, por lo tanto, es mejor hacer astrocitos frescos cada vez que se dividen los NPCs.
3. Para sembrar para experimentación, divida los astrocitos usando tripsina o solución de desprendimiento celular como se describe en los pasos 2.1-2.7. Las densidades de siembra recomendadas se incluyen en el Cuadro 2.

Tipo de placa	Astrocitos por pozo
384 pozos	2500
96 pozos	10000
24 pozos	40000
6 pozos	150000

Tabla 2. Densidad de siembra recomendada de iAs por área de placa. Número típico de iAs sembrados para generar una monocapa en las placas de cultivo de tejidos más comunes.

4. Preparación y descongelación de porciones para la diferenciación de astrocitos de las existencias congeladas de NPC (alternativa a la etapa 3)

NOTA: Como alternativa al mantenimiento de iNPCs en cultivo, los astrocitos también se pueden producir directamente a partir de una población congelada. Para ello, los iNPCs se congelan en porciones más pequeñas. La Tabla 3 muestra los volúmenes sugeridos de congelación y descongelación para que las porciones se descongelen en un plato de 10 cm que contiene 10 mL de medios de astrocitos.

Tamaño de la porción	Suspensión celular (μL)	Medios de congelación (μL)	Volumen total (μL)	Descongelación en
4x	400	400	800	Dos platos de 10 cm
2x	200	200	400	Un plato de 10 cm

Tabla 3. Instrucciones sobre cómo porciones de iNPC para generar iAs. Proporción de medios de suspensión y congelación iNPC para generar porciones. Tenga en cuenta que la concentración final de DMSO es del 10% cuando la suspensión celular se mezcla con medios de congelación.

1. Para hacer astrocitos a partir de existencias congeladas de iNPC, retire el vial de la porción del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido y descongele rápidamente a 37 ° C. Tan pronto como las células se descongela, pipete la solución celular en un tubo de 15 mL que contiene 5 mL de medios de astrocitos.
2. Centrífuga durante 4 min a 200 x g y temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y resuspend en 1 mL de medio de astrocito fresco.
3. Añadir 9 mL de medio de astrocito fresco a un plato de 10 cm recubierto de fibronectina y añadir 1 mL de solución celular. Distribuir suavemente las células en movimiento norte-sur-este-oeste. Cultivar células a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos de CO_{2 al 5%.}

Resultados

Este protocolo permite la generación rápida y fácil de iNPCs directamente de fibroblastos de la piel humana usando retrovirus que contienen los factores de Yamanaka. Este método permite evitar el estado de las células madre y la necesidad de selección clonal, evitando así la variación clonal. Los pasos importantes a tener en cuenta mientras las células se someten al proceso de conversión son la densidad de siembra de fibroblastos, el pH de los medios y el mantenimiento de las células en una confluencia óptima. Ejemplos de confluencia de división óptima y cambios de morfología durante el proceso de conversión se pueden encontrar en la Figura 1.

Figura 1. Imágenes representativas del proceso de conversión después de agregar la mezcla retroviral de factores de Yamanaka. Los fibroblastos fueron sembrados y transducidos veinticuatro horas más adelante con los factores de Yamanaka. Dos días después del virus (DPV), los medios se cambiaron a medios de conversión. Las células fueron cultivadas en medios de conversión hasta que estuvieron listas para pasar (13 DPV). Las células fueron sembradas después del paso para alcanzar el 80% de confluencia al día siguiente (14 DPV). Los pasajes posteriores mantuvieron esta densidad hasta que las células progenitoras neuronales comienzan a dividirse rápidamente. La barra de escala es de 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez completado el proceso de conversión, los NPCs mostrarán una expresión fuertemente reducida o ninguna expresión de los marcadores de fibroblastos y morfología, y expresarán los marcadores celulares específicos de NPC(Figura 2). Además, también se pueden utilizar para generar diferentes líneas celulares, como iNs, iOs e iAs.

Figura 2. Las células que se someten al proceso de conversión expresan marcadores específicos de la célula. Los fibroblastos pacientes (a), las células neuronales inducidas del progenitor (iNPCs (b) y las células inducidas de Astrocytes (iAs (c) fueron sembradas en los coverslips de cristal en una placa tratada cultura del tejido del pozo 24. Las células immunostained para: los marcadores específicos de la célula del fibroblasto (a), Vimentin (verde) y TE7 (rojo), marcador específico de la célula del iNPC (b), Nestin (rojo), y marcador nestin (verde) de la célula del iAs (c) GFAP (púrpura) y marcador Nestin (verde) del iNPC. La barra de escala es de 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En nuestra experiencia, los iAs en particular son muy valiosos para las pruebas de mecanismos de fármacos y enfermedades, ya que se pueden generar en poblaciones puras (98% o más células GFAP positivas²⁹⁾en grandes números reproducibles. Los iAs se pueden diferenciar de los iNPCs tomando una pequeña alícuota de células durante la división o una porción de iNPC previamente congelada y directamente enchapado en medios de astrocitos. Consideraciones importantes durante este proceso son mantener baja la densidad de siembra inicial de los iNPCs(Figura 3 y Figura 4),ya que se ha demostrado que una alta densidad dificulta el proceso de diferenciación(Figura 4)y prestar atención adicional al pH de los medios, ya que la acidificación puede activar incluso astrocitos sanos.

Figura 3. Imágenes representativas del proceso de generación de iAs a partir de iNPCs. Los iNPCs se siembran en medios de astrocitos (Tabla 1) a una baja densidad de siembra. Una buena densidad de siembra es de aproximadamente el 10% en el primer día después de la siembra (DPS) (izquierda); sin embargo, esta densidad se puede ajustar de acuerdo con la tasa de crecimiento de las células. La morfología típica de iAs se puede observar después de 5 DPS (medio). En algunos casos, se puede observar una morfología aberrante de astrocitos, con extensiones largas y puntiagudas. Este cambio es indicativo de la activación de astrocitos y puede ser secundario al estado de la enfermedad o técnicas de cultivo incorrectas (derecha). La barra de escala es de 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. La densidad de siembra de iNPC afecta la eficiencia de diferenciación de iAs. Las líneas de control iNPC se sembraron a baja (A) y alta densidad (B) en medios de astrocitos para demostrar los efectos de la densidad de siembra en la diferenciación. 5 DPS, la línea de baja densidad expresó marcadores específicos de astrocitos, mientras que la línea de alta densidad muestra una mezcla de marcadores iNPC e iAs con una marcada morfología similar a iNPC. La barra de escala es de 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1. Cifras adicionales del proceso de conversión después de agregar la mezcla retroviral de factores de Yamanaka. Imágenes del proceso de conversión a 12 DPV (1 día antes del paso) y 19 DPV (6 días después del paso). Nótese la diferencia en la morfología entre las células antes y después del paso, en 12 células DPV tienen una morfología de estructura similar a una bola. Después de un pasaje y varios días en los medios de conversión (tabla 1) las células comienzan a mostrar una morfología similar a la de NPC. La barra de escala es de 200 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En resumen, la conversión directa es un método rápido y fácil para generar células progenitoras neuronales inducidas a partir de fibroblastos cutáneos de pacientes. Este método es ventajoso debido a su velocidad, así como la gran cantidad de celdas generadas que son fáciles de mantener. Además, la creciente evidencia sugiere que los métodos de reprogramación directa eliminan menos marcas epigenéticas en comparación con la tecnología clásica de reprogramación iPSC, por lo que el entorno de la enfermedad está más intacto^4,7,8. La diferenciación de iNPCs a astrocitos es muy sencilla y altamente reproducible incluso entre múltiples laboratorios independientes^19,29,33. Los iNPCs pueden congelarse en pequeñas porciones y descongelarse directamente para fines de diferenciación, lo que ayuda a reducir la variación entre los experimentos, ya que los números de paso se pueden mantener similares. Los astrocitos juegan un papel crucial en la progresión de la enfermedad en muchas enfermedades neurológicas y, por lo tanto, son un tipo de célula interesante para trabajar. Los astrocitos se pueden utilizar para estudios mecanicistas, estudios metabólicos o ensayos de pruebas de drogas y generalmente se cultivan como monocapas. Además, los astrocitos se pueden combinar en sistemas de co-cultivo con neuronas de ratón o humanas para evaluar el impacto de los astrocitos en la supervivencia neuronal y la morfología, los cuales son buenas lecturas para las pruebas de drogas³⁴.

Para utilizar con éxito este protocolo, algunos puntos y limitaciones potenciales necesitan ser mantenidos en mente. Los fibroblastos de la piel humana, por ejemplo, varían mucho en su tasa de división celular, así como en la respuesta a los vectores virales. Dado que estas no son líneas celulares estandarizadas, son tan variables como la propia humanidad, cada línea es diferente. En cuanto a muchos métodos de reprogramación, es más fácil reprogramar fibroblastos que tienen una tasa de división celular moderada a rápida en comparación con las células que apenas se replican. La tasa de replicación puede verse afectada por la calidad de la biopsia de piel y el procesamiento en sí, por el número de paso de los fibroblastos, así como la manipulación. Cuando se trabaja con fibroblastos primarios de la piel, es importante no dejar que las células se vuelven demasiado densas para evitar la inducción de la senescencia. Si los fibroblastos no crecen bien, lo mejor es probar una nueva cepa o un pasaje más bajo, aunque en algunos casos, la enfermedad en sí también podría desempeñar un papel. La división celular a veces se puede mejorar mediante el uso de 15% o 20% FBS en los medios de fibroblastos en comparación con el 10% estándar.

La calidad de los vectores virales de reprogramación es de gran importancia para el éxito. En nuestras manos, los vectores retrovirales fueron más eficientes en comparación con los vectores lentivirales u otros virus no integradores; sin embargo, esto podría depender de la calidad y pureza del vector viral. Los kits retrovirales comerciales del vector especifican generalmente la concentración viral del vector y a menudo también una multiplicidad de infección para cierta variedades de células. Es importante tener en cuenta que los fibroblastos primarios difieren de la línea celular utilizada por las empresas para determinar la absorción de vectores virales. Además, incluso cuando se pide el mismo kit comercial, la variación entre lotes es común. Por otra parte, la absorción de vectores virales también varía entre las variedades de células del fibroblasto. Algunas líneas podrían ser más sensibles y, por lo tanto, las células transducidas podrían morir, mientras que otras líneas celulares podrían ser más resistentes a la absorción viral. Por lo tanto, determinar la eficiencia de transducción para una línea celular dada puede ser importante, especialmente si la línea celular está creciendo lentamente o los intentos de conversión anteriores fallaron. En nuestras manos, la mejor manera de evaluar cuánto de un vector retroviral específico se necesita para la conversión es realizar una tinción inmunofluorescente con varias diluciones del vector viral. El número de células que expresan el transgén para cada vector puede entonces ser contado, con el objetivo de una eficiencia de transducción del 70% o superior. En nuestra experiencia, mois similares se pueden utilizar para la mayoría de las variedades de células sin embargo el MOI se puede ajustar si es necesario.

Durante el proceso de conversión, es fundamental no dividir las celdas demasiado pronto. El tiempo hasta que las células estén listas para ser divididas depende de múltiples factores, incluyendo la línea celular primaria y sus características, la calidad del vector viral utilizado y la calidad de los medios. Es importante destacar que la tasa de éxito de la conversión es mucho mayor cuando las células se mantienen en alta densidad. Incluso si las células comienzan a cambiar de morfología, es mejor dejar las células en el primer pozo más tiempo que dividirlas prematuramente. Si la división ocurre demasiado pronto, la conversión puede detenerse en su progreso y llevar a las células a diferenciarse de nuevo a la forma y el comportamiento similares a los fibroblastos. Además, diluirlos demasiado pronto puede resultar en cuerpos celulares más alargados en comparación con los cuerpos celulares pequeños y compactos de los NPCs observados previamente. Por lo tanto, las primeras divisiones siempre deben ser conservadoras; es mejor mantener las células demasiado densas con una división de 1:1 o 1:2 en comparación con diluirlas demasiado. Se espera cierta muerte celular después de la división inicial. Cabe destacar que las celdas siempre se ven peor (más planas) el primer día después de la división, lo cual es normal. Los mejores juicios sobre la forma de la célula deben hacerse 2-3 días más tarde. Es importante destacar que la calidad de los factores de crecimiento y los componentes de los medios también es crucial. Es importante preparar pequeñas cantidades de medios que contengan factores de crecimiento para que los medios completamente preparados solo se utilicen durante un máximo de 5-7 días. No mantenga los medios a temperatura ambiente o 37°C durante períodos prolongados de tiempo. Use rápidamente y refrigere tan pronto como se realice el cambio de medio. Además, mantener el volumen de medios bajo en 1 mL en lugar de 2 mL puede ayudar especialmente para las líneas celulares que son más resistentes a la conversión. Si las células consumen el medio rápidamente, que se puede observar por un cambio en la forma de color del medio de rojo a amarillo (tasa de acidificación), ajuste el volumen del medio hasta 2 mL. El rápido consumo de medios de comunicación es una señal positiva y a menudo se observa en etapas posteriores de la conversión junto con una mayor proliferación.

Los NPCs también son muy sensibles a la presencia de accutase en los medios de comunicación y es muy importante mantener el tiempo de incubación de accutase corto. Recomendamos un período de incubación de 2-4 minutos, revisar las células con frecuencia bajo el microscopio para ver cuándo se han desprendido. Es esencial centrifugar las células después de la división para eliminar la mezcla de enzimas del medio. También es importante tener en cuenta el número de pasaje, ya que las líneas celulares pueden cambiar al cultivarse durante un cultivo prolongado que conduce a la alteración de los perfiles de expresión. Por lo tanto, es importante congelar muchas poblaciones de células en los primeros pasajes. Las células deben congelarse en medios 10% DMSO y 90% NPC y almacenarse a largo plazo en nitrógeno líquido. Debido a la falta de suero en este medio, es fundamental garantizar una congelación lenta utilizando cámaras de congelación y una vez congelado durante la noche, transferir inmediatamente al nitrógeno líquido. Mientras que no se realiza ninguna selección clónica en este protocolo, es posible que el cultivo y el passaging extendidos llevan a la selección natural de una población inicial de la célula con tasa favorable del crecimiento y de la supervivencia. Por lo tanto, es importante tener en cuenta el número de pasaje y el manejo al realizar experimentos. Preferimos usar pasajes más bajos para experimentos, si es posible, no superamos el paso de las líneas celulares por más de 20 veces. Dado que los NPC crecen rápidamente, un gran número de poblaciones pueden congelarse en pasajes más bajos para experimentos. Las líneas celulares con tasas de crecimiento particularmente altas tienen un mayor riesgo de acidificación de los medios. Por lo tanto, a medida que las líneas celulares crecen con diferente velocidad, la cantidad de medios podría necesitar ser ajustada en función de la proliferación. Si las células se dejan continuamente en medios altamente acidificados, puede influir en la salud de las líneas celulares de control y enfermedad. Esto hace que incluso los astrocitos sanos se vuelvan reactivos, afectando su uso en una mayor diferenciación y experimentos.

Para la diferenciación de astrocitos, es importante mantener las células en baja densidad, ya que la alta densidad evitará que las células se diferenciven y seguirán proliferando a tasas más altas. Por lo tanto, la densidad de siembra debe ajustarse para cada línea celular dependiente de su tasa de proliferación. Recomendamos probar diferentes densidades de siembra y realizar tinciones/RT-PCR con marcadores de astrocitos para asegurar una diferenciación adecuada. La calidad de los IOS se puede evaluar junto con controles saludables mediante ensayos de co-cultivo con neuronas. Siempre que la patología de la enfermedad no conduzca a un fenotipo reactivo, las neuronas deben permanecer viables en contacto con iAs durante varios días. La morfología de los astrocitos puede variar mucho entre las líneas celulares individuales y también puede verse afectada por el fenotipo de la enfermedad. Además, en enfermedades donde los astrocitos se ven fuertemente afectados, podrían mostrar un fenotipo reactivo con extensiones grandes y alargadas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plato de estilo de 100 mm x 2 mm, tratamiento con cultivo celular, Corning no pirogénico	430167	cultivo de tejidos
Tubos de centrífuga con tapón de rosca cónico de 15 ml, polipropileno copolímero	USA Scientific	1475-1611	Se utiliza para levantar y centrífugas celdas
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml USA	Scientific	1500-1811	Preparación de medios
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Gibco	15240062	Antibiótico con actividad antifúngica para la preparación
de medios B-27  Suplemento (50X), sin suero	Invitrogen	17504044	Para NPC y medios
base Viales criogénicos  1.2ML	Corning	CLS430658-500EA	Para congelar existencias celulares
DMEM, glucosa alta, GlutaMAX  Suplemento, piruvato	Gibco	10569010	Para fibroblastos y medios de astrocitos
DMEM/F-12, GlutaMAX  suplemento	Gibco	10565042	Para NPC y medios base
DMSO	Sigma	D2438-50ML	Para congelar existencias celulares
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	14190136	Referido en el protocolo como PBS. Para la dilución de fibronectina y el lavado celular
Kit de reprogramación EZ Retrovirus iPSC	ALSTEM	RF101	Retrovirus que contiene los factores de Yamanaka. El virus también se puede fabricar internamente.
Suero fetal bovino, certificado	Gibco	16000-036	Referido en protocolo como FBS. Para medios de fibroblastos y astrocitos
Jeringas estériles Fisherbrand de un solo uso	Fisher	14-955-461	Medios filtrantes (50 ml)
Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina	Sigma	H3149-10KU	Referida en el protocolo como heparina. Se utiliza en los medios de conversión. Polvo diluido en agua ultrapura. Concentración final de 5000X
Proteína purificada de fibronectina en plasma humano	Millipore Sigma	FC010-10MG	Referida en protocolo como fibronectina, utilizada en dilución 1:200 para el recubrimiento.
Isopropanol (grado técnico)	Fisher Scientific	S25372A	Para la congelación de células
Mr. Frosty	Thermo Fisher	5100-0001	Para la congelación
de células N-2 Suplemento (100X)	Gibco	17502048	Para astrocitos, NPC y medios base
EGF humano recombinante	Preprotech	AF-100-15	Referido en el protocolo como EGF, utilizado en los medios de conversión. Polvo diluido en PBS, concentración final de 1 mg/mL, almacenado en pequeñas alícuotas congeladas
FGF humano recombinante-básico	Preprotech	100-18B	Referido en el protocolo como FGF, utilizado en NPC y medios de conversión. Polvo diluido en PBS, concentración final de 1 mg/mL, almacenado en pequeñas alícuotas congeladas
StemPro Accutase Reactivo de Disociación Celular	Gibco A1110501		Referido en protocolo como Accutase. Se utiliza para levantar durante el proceso de conversión y NPC.
Sistema de filtración al vacío estéril Stericup Quick Release-GP Millipore	Sigma	S2GPU05RE	Filtración de medios
Placa de cultivo de tejidos, 6 pocillos, fondo plano con tapa de baja evaporación	Fisher	08-772-1B	Cultivo de tejidos
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo de fenol	Invitrogen	25300062	Levantamiento de fibroblastos y astrocitos
Filtros de jeringa Whatman Puradisc 25, 0,2 μ m, PES estéril	Millipore Sigma	80-2502	Medios filtrantes (50 ml)