Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

Summary

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Abstract

Las mitocondrias son orgánulos esenciales de células eucariotas capaces de respirar aeróbicos. Contienen genoma circular y aparatos de expresión génica. Un genoma mitocondrial de la levadura de panadero codifica ocho proteínas: tres subunidades del citocromo c oxidasa (Cox1p, Cox2p y Cox3p), tres subunidades de la sintasa ATP (Atp6p, Atp8p y Atp9p), una subunidad de la enzima oxidorreductasa ubiquinol-citocromo c, citocromo b (Cytb) y la proteína ribosomal mitocondrial Var1p. El propósito del método descrito aquí es etiquetar específicamente estas proteínas con metionina ³⁵S, separarlas por electroforesis y visualizar las señales como bandas discretas en la pantalla. El procedimiento implica varios pasos. En primer lugar, las células de levadura se cultivan en un medio que contiene galactosa hasta que llegan a la etapa de crecimiento logarítmico tardío. A continuación, el tratamiento con cicloheximida bloquea la traducción citoplasmática y permite la incorporación de metionina ³⁵S solo en productos de traducción mitocondrial. Luego, todas las proteínas se extraen de las células de levadura y se separan por electroforesis de gel de poliacrilamida. Finalmente, el gel se seca e incuba con la pantalla de fósforo de almacenamiento. La pantalla se escanea en un fosforimagen que revela las bandas. El método se puede aplicar para comparar la tasa de biosíntesis de un solo polipéptido en las mitocondrias de una cepa de levadura mutante en comparación con el tipo salvaje, que es útil para estudiar defectos de expresión génica mitocondrial. Este protocolo proporciona información valiosa sobre la tasa de traducción de todos los mRNAs mitocondriales de levadura. Sin embargo, requiere varios controles y experimentos adicionales para sacar conclusiones apropiadas.

Introduction

Las mitocondrias son los orgánulos profundamente involucrados en el metabolismo de una célula eucariota. Su cadena de transferencia de electrones suministra a la célula ATP, la principal moneda energética utilizada en múltiples vías bioquímicas. Además, están involucrados en apoptosis, síntesis de ácidos grasos y hemo, y otros procesos. La disfunción de las mitocondrias es una fuente bien conocida de la enfermedad humana^1. Puede ser el resultado de mutaciones en genes nucleares o mitocondriales que codifican componentes estructurales o reglamentarios de los orgánulos^2. La levadura saccharomyces cerevisiae de Baker es un excelente organismo modelo para estudiar la expresión génica mitocondrial debido a varias razones. En primer lugar, su genoma está completamente secuenciado^3,bien anotado, y una gran suma de datos ya está disponible en la literatura gracias a la larga historia de investigaciones llevadas a cabo con este organismo. En segundo lugar, las manipulaciones con su genoma nuclear son relativamente rápidas y fáciles debido a su rápida tasa de crecimiento y su sistema de recombinación homóloga altamente eficiente. En tercer lugar, la levadura de panadero S. cerevisiae es uno de los pocos organismos para los que se desarrollan las manipulaciones con genomas mitocondriales. Por último, la levadura de panadero es un organismo facultativo aerobe-anaerobe, que permite el aislamiento y estudio de mutantes respiratorios defectuosos, ya que pueden crecer en medios que contienen fuentes de carbono fermentables.

Describimos el método para estudiar la expresión génica mitocondrial de la levadura de panadero S. cerevisiae en el nivel traslacional^4. Su principio principal proviene de varias observaciones. En primer lugar, el genoma mitocondrial de levadura codifica sólo ocho proteínas: tres subunidades del citocromo c oxidasa (Cox1p, Cox2p y Cox3p), tres subunidades de la sintasa ATP (Atp6p, Atp8p y Atp9p), una subunidad de la enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductasa, citocromo b (Cytb) y la proteína ribosomal mitocondrial Var1p^5. Este número es pequeño, y todos ellos pueden ser separados por electroforesis en un solo gel en las condiciones adecuadas. En segundo lugar, los ribosomas mitocondriales pertenecen a la clase procariota en lugar de eucariota^6,y por lo tanto, la sensibilidad a los antibióticos es diferente para los ribosomas citoplasmáticos y mitocondriales de levadura. Permite la inhibición de la traducción citoplasmática con cicloheximida, proporcionando las condiciones cuando el aminoácido etiquetado⁽³⁵S-metionina) se incorpora sólo en productos de traducción mitocondrial. Como resultado, el experimento proporciona información sobre la tasa de incorporación de aminoácidos en proteínas mitocondriales sintetizadas de novo, reflejando la eficiencia general de la traducción mitocondrial para cada uno de los ocho productos

Protocol

1. Preparación de la cultura de levadura

1. Levadura de rayas de los cultivos de caldo congelado en platos frescos con el medio adecuado. Ponga las placas en una incubadora de cultivo a 30 °C durante 24-48 h.
   NOTA: Deje que los mutantes sensibles a la temperatura crezcan a la temperatura permisiva.
2. Inocular cultivos de levadura en 2 ml de media YPGal (2% peptona, 1% extracto de levadura, 2% galactosa) de la veta fresca en tubos de 15 ml e incubarlos durante la noche agitando a 200 rpm a 30 °C.
3. Mida la densidad óptica del cultivo a una longitud de onda de 600 nm (OD_600).
4. Tome el volumen correspondiente a 0,2 unidades de absorbancia en tubos estériles, células de levadura de pellets a 9.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
5. Lave las células con 0,5 ml de agua estéril por vórtice durante 5 s. Células de levadura de pellets a 9.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Diluir las células en 2 ml de medio YPGal fresco.
6. Incubar agitando a 200 rpm y 30 °C hasta que OD₆₀₀ alcance valores de 1,5–1,9.
   NOTA: Las tasas de crecimiento de levadura varían, así que prepárate para esperar. Es razonable hacer los pasos 1.3–1.6 temprano en la mañana. Por lo general, toma 4-5 h, pero puede tomar más tiempo.

2. Incorporación de isótopos radiactivos

1. Transfiera el volumen de cultivo equivalente a una unidad óptica en un tubo de microcentrífuga. Gire los tubos a 3.000 x g durante 1 minuto y deseche el sobrenadante. Lavar con 0,5 ml de agua estéril por vórtice durante 5 s.
   1. Células de levadura de pellets a 9.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Células de levadura resuspend en 0,5 ml de búfer de traducción estéril. Coloque la suspensión en un tubo de 15 ml.
      NOTA: El búfer de traducción es una solución que contiene 2% de galactosa (w/v) y fosfato de potasio de 50 mM con pH 6.0.
2. Añadir cicloheximida a la suspensión celular hasta una concentración final de 0,2 mg/ml. Incubar durante 5 minutos agitando a 200 rpm y 30 °C para inhibir la traducción citosólica.
   NOTA: La solución de cicloheximida (20 mg/ml, en etanol) debe prepararse fresca antes del experimento. El cloranfenicol se puede sustituir con éxito por anisomicina en la misma concentración^7.
3. Añadir 25–30 μCi de ³⁵S-metionina a la suspensión celular e incubar durante 30 minutos agitando a 200 rpm y 30 °C.
   NOTA: También se puede utilizar la mezcla de ³⁵S-metionina y ³⁵S-cisteína. Pura ³⁵S-metionina resulta en la señal más fuerte y la mejor relación señal-ruido. Generalmente, la metionina es más eficaz que la cisteína porque el contenido de este aminoácido en proteínas mitocondriales es mayor. Sin embargo, la mezcla EasyTag de ³⁵S-metionina y cisteína es menos costosa y da resultados comparables⁷.
   PRECAUCIÓN: ³⁵S-metionina es radiactiva. Siga las prácticas de seguridad habituales para el manejo de materiales radiactivos.
   NOTA: Es bien sabido que la incorporación de radiactividad alcanza un límite debido al cual las señales totales se nivelan con el tiempo. Una vez alcanzado este límite, es casi imposible determinar las tarifas por las que se sintetizan los diferentes productos de traducción. Para analizar la tasa de traducción mitocondrial, es imperativo estar en una condición en la que la intensidad de la señal aumenta con el tiempo de incubación con ³⁵S-metionina de una manera lineal. Para cepas comunes de tipo salvaje de laboratorio, la señal ya está saturada para tiempos de incubación mucho más cortos que los 30 minutos. Los mutantes traslacionales pueden comportarse de manera muy diferente. Se debe realizar un curso de tiempo para establecer la cinética de la incorporación de radiactividad y, por lo tanto, la tasa de traducción, al menos cuando se trabaja con una nueva cepa. Para ello, sugerimos tomar muestras con un intervalo de varios minutos (por ejemplo, 2,5, 5,0, 7,5, 10 y 20 minutos).
4. Añadir metionina "fría" sin etiquetar (la concentración final debe ser de 20 mM) y puromycine (la concentración final debe ser de 1-10 μg/ml) para detener el etiquetado. Incubar durante 10 minutos agitando a 200 rpm y 30 °C.
   NOTA: Este paso es fundamental para dar a los ribosomas tiempo para terminar de traducir los péptidos. De lo contrario, todos los polipéptidos más cortos que la longitud completa se detectarán a un tamaño diferente. Un experimento de tiempo (pulso-persecución) se puede hacer en este paso para determinar la estabilidad de los productos de traducción mitocondrial. Para ello, continúe la incubación tomando muestras con un intervalo de 30 min (por ejemplo, 30, 60, 90 y 120 min).

3. Lisis celular de levadura y extracción de proteínas

1. Recoger las células de levadura por centrifugación a 9.000 x g durante 30 s. Lave las células con 0,5 ml de agua estéril por vórtice durante 5 s. Células de levadura de pellets a 9.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
   nota. El protocolo se puede pausar aquí. Almacene las muestras a -20 °C.
2. Añadir 75 μL de tampón de lisis al pellet y vórtice durante 5-10 s.
   NOTA: El tampón de lisis es una solución de 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoetanol y 1 mM PMSF en agua. Evite la incubación excesiva con el amortiguador de lisis que conduce a la hidrólisis alcalina de proteínas. Proceda inmediatamente al paso 3.3.
3. Añadir 500 μL de búfer Tris-HCl de 0,5 M con pH 6.8. Vórtice brevemente.

4. Precipitación de proteínas

PRECAUCIÓN: El metanol y el cloroformo son disolventes orgánicos. Siga las prácticas de seguridad habituales para el manejo de sustancias orgánicas.

1. Añadir 600 μL de metanol a la muestra. Vórtice para 5 s.
2. Añadir 150 μL de cloroformo a la muestra. Vórtice para 5 s.
3. Centrífuga las muestras durante 2 min a 12.000 x g. Deseche cuidadosamente la fase superior con un muestreador.
4. Añadir 600 μL de metanol a la muestra. Mezcle cuidadosamente invirtiendo el tubo varias veces.
5. Centrífuga las muestras durante 2 min a 12.000 x g. Deseche el sobrenadante.
6. Seque al aire el pellet durante 2 min a 80 °C.
   NOTA: Todo el líquido debe evaporarse. Existe el riesgo de tener una separación aberrante de proteínas en el gel si el pellet se secó insuficientemente. Sin embargo, no es posible secar en exceso el pellet, por lo que incluso se puede almacenar durante la noche a 4 °C.
7. Disolver proteínas precipitadas en 60 μL de 1x tampón de muestra Laemmli.
8. Caliente durante 10 minutos a 40 °C.
   NOTA: Evite hervir las muestras a 95 °C, ya que esto provoca agregación. Si los agregados todavía se forman, gire las muestras a 12.000 x g durante 2 minutos y recoja el sobrenadante. Las muestras se pueden almacenar a -20 °C. El protocolo se puede pausar aquí.

5. SDS-PAGE

1. Laemmli SDS-polyacrylamide gel al 17,5%.
   NOTA: 6 M urea se puede añadir al gel para resolver mejor atp8 y atp9. Gradiente 15%–20% geles también puede dar una mejor resolución.
2. Cargue 15 μL (40–50 μg) de cada muestra en los bolsillos.
   NOTA: No es necesario medir la concentración de proteínas si los valores de OD₆₀₀ estaban cerca en el paso 1.6. Si no es así, mida las concentraciones de proteínas utilizando el ensayo con reactivos compatibles con detergente.
3. Ejecute el gel en una habitación fría hasta que el tinte azul alcance aproximadamente el 65% de la longitud del gel.
   NOTA: Para el sistema utilizado (por ejemplo, celda Protean II xi), utilizamos cualquiera de los dos modos: 16-17 h a 5 V/cm o 5 h a 15 V/cm. Ninguna proteína funciona más rápido que el tinte azul bromophenol, pero las carreras largas pueden resultar en el desenfoque de las señales atp8 y atp9.
4. Manchar el gel con Coomassie azul brillante y hacer un escaneo o foto, que se requiere como un control de carga.
   NOTA: Una forma alternativa de hacer un control de carga es el inmunoblotting con un anticuerpo al gen mitocondrial "house-keeping", por ejemplo, la porína 1.

6. Autoradiografía

1. Seque el gel en un gel-secador. Guárdalo en el cassette con una pantalla de fósforo de almacenamiento durante 3-5 días.
   NOTA: Una alternativa a la detección del gel seco es la transferencia de proteínas a una membrana nitrocelulosa mediante electro-hinchazón y cribado a partir de entonces. Resulta en señales más fuertes y bandas más nítidas.
2. Escanee la pantalla en un fosforimagen.
   NOTA: Como alternativa a las imágenes de fósforo, la película de rayos X también se puede utilizar para revelar las señales.

Results

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, asignamos productos de traducción mitocondrial de dos cepas S. cerevisiae: el tipo salvaje (WT) y una eliminación de rodamientos mutantes del gen AIM23 (AIM23Δ), que codifica el factor de iniciación de traducción mitocondrial 3 (Cuadro 1)⁸. Los productos de traducción mitocondrial fueron etiquetados radiactivamente y separados en SDS-PAAG9. Las muestras se recogieron cada 2,5 minutos antes de la sat...

Discussion

Las investigaciones sobre la expresión génica ocupan una parte central en las ciencias de la vida modernas. Se han desarrollado numerosos métodos que proporcionan información sobre este complejo proceso. Aquí, describimos el método que permite acceder a la biosíntesis proteica en la levadura de panadero S. cerevisiae mitocondrias. Por lo general, se aplica para comparar las eficiencias de traducción de los ARNM en las mitocondrias de la cepa de levadura mutante frente al tipo salvaje para acceder a las consecuen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrilamida	Sigma-Aldrich	A9099
Persulfato de amonio	Sigma-Aldrich	A3678
Agar bacteriológico	Sigma-Aldrich	A5306
Densímetro celular Biowave CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
CUBETAS desechables estándar de MARCA	Sigma-Aldrich	Z330361
cloroformo	Sigma-Aldrich 288306
cicloheximida	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactosa	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G7021
calefactor de bloque digital	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Metionina, 500µ Ci (18.5MBq), solución acuosa estabilizada	Perkin Elmer	NEG709A500UC
centrífuga Eppendorf 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Cribas de fósforo de almacenamiento	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-metionina	Sigma-Aldrich	M9625
metanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiamina	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Metilenebisacrilamida	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Incubadora Shaker New	Brunswick Peptona
científica de carne, bacteriológica	Millipore	91249
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo	Sigma-Aldrich	P7626
Kit de ensayo de proteínas Pierce de 660 nm	Thermo Scientific	22662
PowerPac Fuente de alimentación básica	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Dihidrocloruro de puromicina de Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	221465
Generador de imágenes de fósforo Storm 865	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Secador de gel calentado al vacío Cleaver	Scientific	CSL-GDVH
Extracto de levadura	Sigma-Aldrich	Y1625