Este protocolo utiliza un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño en el ADN inducido por PM2.5en los corazones disecados de embriones de pez cebra.
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Artículo de método
Uso de la inmunofluorescencia para detectar el daño al ADN inducido por PM2.5en corazones de embriones de pez cebra
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Resumen
Resumen
La exposición a partículas finas ambientales (PM2.5)puede conducir a toxicidad para el desarrollo cardíaco, pero los mecanismos moleculares subyacentes aún no están claros. La 8-hidroxi-2'desoxigenasa (8-OHdG) es un marcador de daño oxidativo del ADN y γH2AX es un marcador sensible para las roturas de doble cadena del ADN. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar cambios en PM2.5-inducidos por 8-OHdG y γH2AX en el corazón de embriones de pez cebra utilizando un ensayo de inmunofluorescencia. Los embriones de pez cebra fueron tratados con materia orgánica extraíble (EOM) a partir de PM2.5 a 5 μg/mL en presencia o ausencia de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0.25 μM) a las 2 h después de la fertilización (hpf). DMSO se utilizó como control de vehículos. A 72 hpf, los corazones se diseccionaron de embriones usando una aguja de jeringa y se fijaron y permeabilizaron. Después de ser bloqueadas, las muestras fueron sondeada con anticuerpos primarios contra 8-OHdG y γH2AX. Las muestras se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios. Las imágenes resultantes se observaron bajo microscopía de fluorescencia y se cuantificaron utilizando ImageJ. Los resultados muestran que la OMA de PM2.5 mejoró significativamente las señales 8-OHdG y γH2AX en el corazón de los embriones de pez cebra. Sin embargo, NAC, actuando como un eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS), contrarrestó parcialmente el daño del ADN inducido por la OMA. Aquí, presentamos un protocolo de inmunofluorescencia para investigar el papel del daño en el ADN en los defectos cardíacos inducidos por PM2.5que se pueden aplicar a la detección de cambios en la expresión de proteínas inducidas por químicos ambientales en los corazones de embriones de pez cebra.
Introducción
La contaminación del aire es ahora un grave problema ambiental que enfrenta el mundo. Las partículas finas ambientales (PM2.5),que es uno de los indicadores más importantes de la calidad del aire, pueden transportar una gran cantidad de sustancias nocivas y entrar en el sistema circulatorio de la sangre, causando graves daños a la salud humana1. Los estudios epidemiológicos han demostrado que la exposición a PM2.5 puede conducir a un mayor riesgo de defectos cardíacos congénitos (CHD)2,3. La evidencia de experimentos con animales también mostró que PM2.5....
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Protocolo
El pez cebra de tipo salvaje (AB) utilizado en este estudio se obtuvo del Centro Nacional de Recursos de Pez Cebra en Wuhan, China. Todos los procedimientos de animales descritos aquí han sido revisados y aprobados por la Institución de Cuidado Animal del Comité de Ética de la Universidad de Soochow.
1. Muestreo de PM2.5 y extracción de compuestos orgánicos
NOTA: PM2.5 se recolectó en un área urbana en Suzhou, China, del 1 al 7 de agosto de 2015, como se describió anteriormente5.
- Hornea filtros de membrana de cuarzo de 47 mm en un horno de silenciador de 500....
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Resultados
Este ensayo de inmunofluorescencia es un método sensible y específico para medir los cambios en la expresión de proteínas en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a productos químicos ambientales.
En este análisis representativo, se evaluaron embriones expuestos a PM2.5 en ausencia o presencia del antioxidante NAC para la presencia de malformaciones cardíacas (Figura 1). Como .......
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Discusión
Aunque el pez cebra es un excelente modelo de vertebrados para estudiar la toxicidad del desarrollo cardíaco de los productos químicos ambientales, debido al pequeño tamaño del corazón embrionario, es difícil obtener suficiente proteína para el análisis de western blot. Por lo tanto, presentamos un método de inmunofluorescencia sensible para cuantificar los niveles de expresión de proteínas de los biomarcadores de daño al ADN en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a PM2.5.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (número de subvención: 81870239, 81741005, 81972999) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo 8-OHdG | Santa Cruz Biotechnology, EE. UU. | SC-66036 | Anticuerpo primario |
| Balanza analítica | Sartorius, China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio, Beijing, China | SW3015 | Para bloquear |
| DAPI | Abcam, EE. UU | ab104139 | Para contratinción nuclear. |
| DMSO | Solarbio,Pekín,China | D8371 | |
| Microscopio de fluorescencia | Olympus, Japón | IX73 | Para la obtención de imágenes de señales de fluorescencia/ |
| Cabra Anti-Conejo IgG Cy3 | Carlsbad,EE.UU. | CW0159 | Anticuerpo secundario |
| Cabra Anti-Conejo IgG FITC | Carlsbad,EE.UU. | RS0003 | Anticuerpo secundario |
| N-acetil-L-cisteína(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Agitador orbital | QILINBEIER, China | TS-1 | |
| Paraformaldehído Sigma | , China | P6148 | Hacer 4% de paraformaldehído para la fijación. |
| Solución salina tamponada con fosfato | HyClone, EE. UU. | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween en PBS para el lavado. |
| Muestreador de PM2.5 | TianHong, Wuhan, China | TH-150C | Para muestreo ininterrumpido de PM2.5 las 24 horas. |
| Sistema de acuicultura de recirculación | HaiSheng, Shanghai, China | El pez cebra se mantuvo en él. | |
| Extractor Soxhlet | ZhengQiao, Shanghai, China | BSXT-02 | Para la extracción de componentes orgánicos. |
| Microscopio estereoscópico | Nikon, Canadá | SMZ645 | Para la disección del corazón de embriones de pez cebra. |
| Metanosulfonato de tricaína (MS222) | Sigma,China | E10521 | Para anestesiar embriones de pez cebra |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γ Anticuerpo H2AX | Abcam, EE. UU | ab26350 | Anticuerpo primario |
Referencias
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C.,....
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Reimpresiones y permisos
