Presentamos un método para la adquisición de cursos de tiempo reportero de fluorescencia de células individuales utilizando matrices micropatterned. El protocolo describe la preparación de matrices unicelulares, la configuración y el funcionamiento de la microscopía de lapso de tiempo de barrido de células vivas y una herramienta de análisis de imágenes de código abierto para la preselección automatizada, el control visual y el seguimiento de los cursos de tiempo de fluorescencia integrados en células por sitio de adhesión.
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Artículo de método
Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) - una técnica versátil para cuantificar la cinética celular
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Resumen
Resumen
Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) es un método versátil para recopilar cursos de tiempo de señales de fluorescencia de células individuales en alto rendimiento. En general, la adquisición de cursos de tiempo unicelulares de células cultivadas se ve obstaculizada por la motilidad celular y la diversidad de formas celulares. Las micro-matrices adhesivas estandarizan las condiciones unicelulares y facilitan el análisis de imágenes. LISCA combina microarrays unicelulares con microscopía de lapso de tiempo de barrido y procesamiento automatizado de imágenes. Aquí, se describen los pasos experimentales de tomar cursos de tiempo de fluorescencia unicelular en un formato LISCA. Transfectamos las células adherentes a una matriz micropatterned utilizando la codificación de ARNm para la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) y supervisar la cinética de expresión de eGFP de cientos de células en paralelo a través de microscopía de lapso de tiempo de barrido. Las pilas de datos de imagen son procesadas automáticamente por un software recientemente desarrollado que integra la intensidad de fluorescencia sobre los contornos celulares seleccionados para generar cursos de tiempo de fluorescencia unicelulares. Demostramos que los cursos de tiempo de expresión de eGFP después de la transfección de ARNm están bien descritos por un modelo de traducción cinética simple que revela la expresión y las tasas de degradación de ARNm. Otros usos de LISCA para las correlaciones del tiempo del acontecimiento de marcadores múltiples en el contexto del apoptosis de la señalización se discuten.
Introducción
En los últimos años, la importancia de los experimentos unicelulares se ha hecho evidente. Los datos de células individuales permiten la investigación de la variabilidad célula a célula, la resolución de correlaciones de parámetros intracelulares y la detección de cinéticas celulares que permanecen ocultas en las mediciones deconjuntos 1,2,3. Con el fin de investigar la cinética celular de miles de células individuales en paralelo, se necesitan nuevos enfoques que permitan el monitoreo de las células en condiciones estandarizadas durante un período de tiempo de varias horas h....
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Protocolo
Figura 2:Adquisición de datos que combina microarrays unicelulares (A) con microscopía de lapso de tiempo de barrido (B). Como preparación del experimento time-lapse, se prepara una matriz unicelular con un micropatrón 2D de cuadrados de adhesión (1), seguido de la siembra celular y la alineación de las células en el micropatrón (2), así como la conexión de un sistema de perfusión al portaobjetos de seis canales, que permite el manejo de líquidos durante la medición de lapso de tiempo (3). Se establece u....
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Resultados
El enfoque LISCA permite recoger de manera eficiente cursos de tiempo de fluorescencia de células individuales. Como ejemplo representativo, describimos cómo se aplica el método LISCA para medir la expresión de eGFP unicelular después de la transfección. Los datos del experimento LISCA se utilizan para evaluar la cinética de administración de ARNm, que es importante para el desarrollo de fármacos eficientes de ARNm.
En particular, demostramos el impacto diferente de dos sistemas de administrac.......
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Discusión
Aquí describimos LISCA como una técnica versátil para seguir la cinética celular de las etiquetas fluorescentes intracelulares a nivel unicelular. Para realizar un experimento LISCA exitoso, cada uno de los pasos descritos de la sección de protocolo debe establecerse individualmente y, a continuación, se deben combinar todos los pasos. Cada uno de los tres aspectos principales de LISCA cuenta con pasos cruciales.
Fabricación de microarrays unicelulares
La calidad del microarray es .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Alemana de la Ciencia (DFG) al Centro de Investigación Colaborativa (SFB) 1032. El apoyo del Ministerio Federal alemán de Educación, Investigación y Tecnología (BMBF) en el marco del proyecto cooperativo 05K2018-2017-06716 Medisoft, así como una subvención de la Bayerische Forschungsstiftung son agradecidos. Anita Reiser recibió el apoyo de una beca DFG a través de la Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ingeniería de polímeros Adtech Microtubos de PTFE | Fisher Scientific | 10178071 | |
| horno para hornear | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Desecador | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Conector Luer Hembra a Tubo | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectina | Yo Proteins | 663 | |
| Juego de filtros eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Tubo de silicona translúcida curada con platino | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Incubadora | Okolab | OKO-H201 | |
| Binder | 9040-0012 | ||
| L-15 sin rojo fenol | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | ||
| Luer | fabricado internamente que consta de teflón | ||
| Luer macho a tubo Conector | MEDNET | MTLS210-6005 | alternativa a los luers macho fabricados internamente |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Válvula sin aguja a conector Luer macho | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Software de imagen Versión 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Adhesivo óptico de curado rápido para el montaje de sistemas |
| de tubos Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | preparada internamente | ||
| Limpiador de plasma | Diener Femto | Oblea de silicio Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | Oblea de silicio SuSoS AG | ||
| con mircorestructuras | fabricadas internamente | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Kit de Elastómero de Silicona | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Mä rzhä usuario | 00-24-626-0000 | |
| Cubreobjetos sin recubrimiento | |||
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | con sporn de repuesto |
Referencias
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).....
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Reimpresiones y permisos
