Ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en las células

Resumen

El ensayo de fuga de fluorescencia es un método simple que permite la investigación de las interacciones péptido/membrana con el fin de comprender su participación en varios procesos biológicos y especialmente la capacidad de los péptidos que penetran en las células para alterar las bicapas de fosfolípidos durante un proceso de translocación celular directa.

Resumen

Los péptidos penetrantes en las células (CPP) se definen como portadores que son capaces de cruzar la membrana plasmática y transferir una carga a las células. Una de las principales características comunes requeridas para esta actividad resultó de las interacciones de los CPP con la membrana plasmática (lípidos) y más particularmente con componentes de la matriz extracelular de la propia membrana (sulfato de heparápalo). De hecho, independientemente de la translocación directa o de la internalización dependiente de la endocitosis, las bicapas lipídicas están implicadas en el proceso de internalización tanto a nivel de la membrana plasmática como a nivel del tráfico intracelular (vesículas endosómicas). En este artículo, presentamos un protocolo detallado que describe los diferentes pasos de una gran formulación, purificación, caracterización y aplicación de vesículas unilamelares (LUV) en el ensayo de fuga de fluorescencia para detectar una posible desestabilización / interacción de la membrana CPP y abordar su papel en el mecanismo de internalización. Las UDV con una composición lipídica que refleja el contenido de la membrana plasmática se generan para encapsular tanto un tinte fluorescente como un quencher. La adición de péptidos en el medio extravesicular y la inducción de interacciones péptido-membrana en las UDV podrían inducir de manera dependiente de la dosis un aumento significativo de la fluorescencia que revela una fuga. Aquí se proporcionan ejemplos con los péptidos anfipáticos (WRAP) ricos en triptófano (W) y arginina (R) recientemente desarrollados, que mostraron una entrega rápida y eficiente de siRNA en varias líneas celulares. Finalmente, se discute la naturaleza de estas interacciones y la afinidad por los lípidos para comprender y mejorar la translocación de la membrana y / o el escape endosomal.

Introducción

Después de su descubrimiento en los años noventa, se desarrollaron péptidos penetrantes en las células (CPP) para promover una entrega celular eficiente de cargas a través de la membrana plasmática^1,2. Los CPP suelen ser péptidos cortos, generalmente de 8 a 30 aminoácidos, que tienen una amplia variedad de orígenes. Primero se definieron como portadores de "translocación directa", lo que significa que pudieron cruzar la membrana plasmática y transferir una carga a las células independientemente de cualquier vía endocitótica, ni el requerimiento de energía ni la participación del receptor. Sin embargo, investig....

Protocolo

1. Preparación de vesículas unilamelares grandes (LUV)

1. Prepare luVs para su uso como imitadores de membrana celular para el ensayo de fuga de fluorescencia.
2. Mezclar con una jeringa de vidrio Hamilton fosfatidilcolina (DOPC, 786.11 g/mol), esfingomielina (SM, 760.22 g/mol) y colesterol (Chol, 386.65 g/mol) en la relación molar 4:4:2. La solución lipídica se obtiene a partir de una solución stock de cada lípido solubilizado en un disolvente de metanol/cloroformo (3/1; volumen/volumen) a 25 mg/ml en un matraz de fondo redondo de vidrio de 25 ml. Sobre la base de 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM y 2 μmol de Chol, la solución lipídica se obtiene de la soluc....

Resultados

El principio del ensayo de fuga de fluorescencia se muestra en la Figura 1. En detalle, las grandes vesículas unilamelares (LUV) que encapsulan un tinte fluorescente y un quencher (sin señal de fluorescencia) se tratan con la biomolécula de interés. Debido a la interacción del péptido con las membranas lipídicas, lo que podría implicar permeabilidad de la membrana, reorganización o incluso ruptura, el colorante de fluorescencia y el quencher se liberan de las.......

Discusión

El ensayo de fuga de fluorescencia presentado es un método simple y rápido para abordar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en la célula. Fácil de hacer, también permite una comparación indirecta entre diferentes péptidos que interactúan con la membrana u otras moléculas que interactúan con la membrana. En cuanto a los pasos críticos del protocolo, ya que este ensayo proporciona valores relativos entre la línea de base (LUVs solas) y la liberación máxima de fluorescencia (condición de Triton), gen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matraz de vidrio de fondo redondo de 25	mL Pyrex
8-aminonaftaleno-1, 3, 6-trisulfónico, sal disódica (ANTS)	Invitrogen	A350	Proteger de la luz
Cloroformo	Sigma-Aldrich	288306
Colesterol	Sigma-Aldrich	C8667
DOPC (dioleoilfosfatidilcolina)	Avanti Polar	850375P	Proteger del aire
Extrusora	Avanti Polar	610000
Fluorímetro	PTI Serlabo
50 µ L jeringa de vidrio	Hamilton	705N
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
LabAssay Fosfolípido	WAKO	296-63801
columna de cromatografía líquida	Sigma-Aldrich
Metanol	Carlo Erba	414902
Membrana de policarbonato Nuclepore (0.1 µ m tamaño de poro, 25 mm de diámetro)	Cubeta
, 10 x 10 x 45 mm	Grener Bio-One	614101
semimicro cubeta de poliestireno, DLS	Fisher Scientific	FB55924
bromuro de p-xileno-bispiridinio (DPX)	Invitrogen	X1525	Proteger de la luz
cubeta de fluorescencia de cuarzo	Hellma	109.004F-QS
sistema rotavapor	Heidolph	Z334898
Resina Sephadex G-50	Amersham	17-0042-01
Azida sódica (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Bañera Sonicator USC300T	VWR	142-6001
Esfingomielina	Avanti Polar	860062P	Protégete del aire
Tritón X-100	Eromedex	2000-B
Zetaziser NanoZS	Malvern	ZEN3500

de poliestireno Whatman 800309